Volume: il mais

Sezione: ricerca

Capitolo: ricerca genetica

Autori: Francesco Salamini, Carlo Lorenzoni

Introduzione

La posizione preminente che il mais occupa fra le colture a livello mondiale ha richiesto grandi investimenti in ricerca e sviluppo nei settori più svariati: dalla biologia alla genetica, alla meccanica, alla fertilizzazione, alla protezione da insetti, funghi e malerbe, al trasporto, alla dietetica, alla chimica dei processi di trasformazione in etanolo e materie plastiche. In questo capitolo ci siamo preoccupati di descrivere, in termini di eventi, uomini e idee, la ricerca svolta negli ultimi due secoli sul mais inteso come specie biologica quasi inventata nella forma addomesticata dall’uomo, specie con caratteri morfo-fisiologici così marcati e facili da studiare da prestarsi a diventare non solo la più importante sorgente di proteine e calorie per la nutrizione di uomini e animali nel mondo, ma anche un modello da laboratorio per approfondire la biologia, la genetica e, più recentemente, la genomica del regno vegetale. La rassegna, considerata a posteriori, si offre a più chiavi di lettura. Due prime e ovvie tematiche, che quasi si contrappongono nel proporsi al lettore, sono rappresentate dalla storia e dai successi della genetica da una parte e da quelli del miglioramento genetico dall’altra. Attraverso queste due tematiche scorrono altri due filoni sperimentali che riguardano: il primo lo studio della variabilità discontinua, mendeliana o delle mutazioni e dei mutanti – studio che, dopo un secolo, rivela a livello molecolare tutte le sue grandi potenzialità; il secondo della variabilità continua, che nelle piante può rappresentare fino al 90% di tutta la variabilità genetica e che è stata la sorgente principale di geni e azioni geniche sfruttati, prima in modo empirico e oggi in modo mirato, dai miglioratori genetici.

Genetica

La genetica del mais nasce nei primi anni del XX secolo. Le condizioni che resero possibili gli sviluppi futuri furono la riscoperta delle leggi di Mendel, lo studio degli effetti di xenia e della doppia fecondazione che introducevano la necessità dell’impollinazione controllata, lo sviluppo di metodi citologici semplici per descrivere i cromosomi e pur tuttavia potenti nella loro capacità risolutiva. Il metodo dell’acetocarminio per colorare i cromosomi, sviluppato da J. Belling, era stato largamente impiegato da E. Sutton per studiare i cromosomi di una cavalletta. Barbara McClintock, assunta per studiare la citologia del mais nel laboratorio di C.E. Randolf presso la Cornell University, decise che il nuovo metodo era molto adatto allo scopo assegnatole. Assieme a H. Hill essa pubblicò, nel 1931, un lavoro sull’associazione dei gruppi di linkage a specifici cromosomi metafasici, che sorprese il mondo per contenuto e innovazione. È durante questi anni che esplode una genetica del mais strettamente vincolata a sicure premesse citogenetiche. Il modello mais raggiunge, in tale periodo, la stessa dignità e importanza scientifica di quello basato sullo studio della Drosophila (il comune moscerino dell’aceto, adottato nel campo animale).

Periodo iniziale e scuola di E.M. East
L’inizio del XX secolo aveva offerto, oltre alla riscoperta delle leggi di Mendel, alcune rilevanti novità biologiche: il collegamento tra la genetica e il materiale ereditario presente nei cromosomi; la scoperta che i fattori ereditari (geni) potevano essere associati nei cromosomi con distanze variabili, espresse in unità di ricombinazione; la prova della natura genetica dei caratteri a variabilità continua e dell’eterosi. In questo contesto di rinnovato interesse verso la disciplina dell’ereditarietà dei caratteri, si inserisce il mais come modello sperimentale. Gli inizi sono confusi: non si definisce chiaramente quanto la necessità di migliorare il mais nelle sue caratteristiche produttive stimoli lo sviluppo di programmi rivolti allo studio di specifici sistemi genici, o quanto le conoscenze genetiche che via via si accumulano per questa pianta aiutino direttamente la pratica selettiva. Per esempio, il lavoro di G.H. Shull e di E.M. East sull’effetto dell’inbreeding e dell’esoincrocio rappresenta uno dei più chiari contributi alla comprensione della natura genetica dei caratteri a variabilità continua, ma contiene anche i germi di tutta la futura teoria e pratica degli ibridi di mais. Secondo Peterson, gli studi di R.A. Emerson sulla variegazione del pericarpo del mais, che introducevano un fenomeno che avrebbe contribuito a metà del secolo a scoprire la trasposizione genica, anche se furono pubblicati nel 1914 erano iniziati già nel precedente decennio del secolo. Emerson, fondatore di una leggendaria scuola di genetica del mais, era professore all’università del Nebraska a Lincoln. In quel periodo il ruolo più visibile e decisivo per lo sviluppo della biologia dei vegetali fu svolto dalla scuola attiva presso la Harvard University, sotto la guida di East. Questi, invitato alla Bussey Institution nel 1909, vi rimase fino alla morte, nel 1939. La sua scuola ebbe una parte primaria nel sostenere lo sviluppo della genetica del mais, ma anche del miglioramento genetico: East fu senza dubbio il punto di riferimento negli Stati Uniti per gli studi di biologia e genetica delle piante nonché per la formazione dei migliori genetisti della prima metà del XX secolo. Egli attrasse molti giovani ricercatori, inclusi D.F. Jones, il proponente del metodo degli incroci a quattro vie per la produzione del seme ibrido di mais, e R.A. Brink, un importante caposcuola di genetica del mais. P. Mangelsdorf e E. Anderson continuarono qui i loro studi sul mais, mentre un altro allievo di East, E. Sears, fondò la più importante scuola di citogenetica del frumento. Anche C. Rick, il più famoso dei genetisti del pomodoro, ebbe qui le sue radici, essendo allievo di K. Sax, a sua volta allievo di East. Il lascito più importante della Bussey Institution si incarnò nel nome di Emerson.

Scuola di R.A. Emerson

Emerson fu chiamato all’Università del Nebraska nel 1915: egli contribuì con importanti risultati alle conoscenze sui geni che controllano il colore della pianta e della cariosside. Presso di lui, McClintock stabilì gli ideotipi dei cromosomi del mais e, in collaborazione con G. Beadle, iniziò la sistematica collezione e descrizione dei mutanti del mais e la loro localizzazione sui cromosomi. La citogenetica del mais si afferma con Barbara McClintock che introdusse nelle analisi citologiche l’uso di specifiche caratteristiche morfologiche dei cromosomi come centromeri, cromomeri, knob. Da subito i nuovi marcatori furono usati per dimostrare gli scambi di materiale genetico durante la meiosi attraverso il crossing-over: essi, fino all’avvento dei marcatori molecolari, hanno rappresentato uno strumento di grande progresso genetico. C.R. Burnham, citogenetista con Emerson alla Cornell University, ha contribuito a creare ampi legami tra citologia e genetica rafforzando così il ruolo modello del mais negli anni tra il ’30 e il ’60 del secolo scorso. Il suo libro Discussion on cytogenetics rimane un classico in questo campo. Laureatosi con Emerson alla Cornell University, M.M. Rhoades, meticoloso e attivo scienziato, nel 1948 si spostò per insegnare citogenetica nell’Università dell’Illinois, un campus universitario con una grande tradizione in genetica, dove in seguito S. Spiegelman e S. Luria lavorarono allo sviluppo della biologia molecolare. Passato all’Indiana University a Bloomington, dove concluse la sua carriera, sviluppò lo studio della perdita di eterocromatina sostenuta dalla presenza di cromosomi B. Certamente egli è stato, con McClintock, della quale era fraterno amico, il ricercatore che ha imposto il mais come modello per gli studi di citogenetica. Già nel 1938 egli descrisse un caso di interazione tra alleli a (assenza di colore nel seme) e il fattore Dt (Dotted) che anticipava la rilevanza dei fenotipi variegati per le ricerche di traslocazione genetica. Originario della scuola di East, R.A. Brink fu attivo dal 1922 al 1968 all’università del Wisconsin. Avendo studiato particolarmente la fisiologia del polline sia in vivo sia in vitro, per primo e indipendentemente da M. Demerec, mise a punto il metodo della soluzione iodo-iodurata per dimostrare la segregazione 1:1 nel polline delle F1 ottenute dall’incrocio tra piante Wx e wx. O.E. Nelson avrebbe più tardi usato questa tecnica per dimostrare la ricombinazione intragenica al locus Wx e, in un lavoro allora non sufficientemente apprezzato in tutte le sue implicazioni, per stabilire che alleli wx causati da elementi trasponibili potevano ricombinare con altri alleli mutati, stabilendo che un trasposone era presente entro il gene. Negli ultimi anni ’40 Brink iniziò le indagini su un fattore genetico indicato come Modulator che reprimeva l’azione dell’allele selvatico al locus P del mais, dimostrando che il fattore si poteva allontanare dal locus, così come rientrarvi, in accordo con i risultati di McClintock sulla trasposizione. R. Laughnan, dal 1948 professore all’Università dell’Illinois e dal 1954 all’Università del Missouri, studiò la struttura del gene e gli eventi di crossing-over non reciproci in un’epoca in cui non si poteva ancora disporre della tecnologia del DNA. Egli ha contribuito alla caratterizzazione del citoplasma maschio-sterile S. Si deve qui mettere in evidenza il ruolo che gli studi sulla maschio-sterilità del mais ebbero nel diffondere, presso i miglioratori genetici, la convinzione che lo sfruttamento dell’eterosi poteva essere praticato in molte piante agrarie.

Gruppo di D.F. Jones: le radici della genetica biochimica e molecolare
Il gruppo era associato al dipartimento di genetica della Stazione sperimentale del Connecticut. Allievo di Jones, Nelson negli anni ’50 si interessò di associare particolari mutanti di mais a specifici caratteri fisiologici. Attivo alle Università di Purdue, Indiana e poi del Wisconsin, Nelson ha rappresentato un riferimento importante per la genetica molecolare degli anni ’80 e ’90 del secolo scorso. Già alla Purdue si dedicò alla dissezione genetica di vie metaboliche, quali quelle della biosintesi dell’amido e della lignina. Come detto, egli chiarì la natura intracistronica degli eventi di ricombinazione interni al gene Wx. Scoprì il valore nutritivo dei mutanti opachi del mais, stimolando a livello internazionale la ricerca sui prodotti di riserva dei semi delle graminacee. Nel suo laboratorio, grazie alle ricerche sull’associazione gene-enzima, è stato possibile sviluppare sonde molecolari per entrare nel genoma del mais. In collaborazione con N. Fedoroff clonò il gene bz, uno dei primi esempi dell’uso dei trasposoni nell’isolamento genico. Il contributo di Nelson è spesso associato a quello di D. Schwartz, allievo di Rhoades che applicò per primo al mais le tecnologie di separazione degli isoenzimi in gel di amido. Gli isoenzimi permettevano spesso di associare i geni e la loro posizione di mappa ai relativi prodotti proteici. Schwarz è stato un fondatore della biologia molecolare delle piante con i suoi precoci interessi sugli enzimi esterasi, alcol-deidrogenasi e saccarosio-sintasi. Più tardi si interessò anche ai meccanismi di trasposizione di Ac, inclusa la metilazione del DNA indotta dalla sua presenza. Si sono formati a questa scuola T. Pryor e M. Freeling, quest’ultimo molto e precocemente attivo nell’avvicinarsi ai problemi dello sviluppo della pianta sfruttando metodi molecolari.

Trasposizione genica
Tre scienziati negli Stati Uniti si interessarono particolarmente alla trasposizione genica: McClintock alla Carnegie Institution, Long Island, Brink all’Università del Wisconsin e Peterson all’Iowa State University. I loro studi stabilirono l’universalità del fenomeno nel mais e stimolarono l’estensione degli esperimenti sull’argomento ad altri organismi. Altri scienziati che, seppure privilegiando temi diversi, hanno contribuito in modo intelligente alla scoperta e alla caratterizzazione dei trasposoni sono i già ricordati Rhoades, Nelson e Schwartz. McClintock arrivò alla Cornell University nel 1919. Dopo varie esperienze presso l’Università del Missouri e la Cornell stessa, dal 1942 è associata al Dipartimento di genetica della Carnegie Institution al Cold Spring Harbor Institute. Diventò vice presidente della Società americana di genetica nel 1939 e nel 1944 membro dell’Accademia nazionale delle scienze americana. Metodologicamente fu attratta dai colori delle cariossidi di mais che sono un’espressione leggibile di fattori genetici facili da studiare. I suoi primi lavori, sviluppati sul mais, sono contributi fondamentali alla citogenetica generale: nel 1931 pubblicò un lavoro dove correlava aspetti della ricombinazione genetica a fenomeni citologici. Verso il 1944 iniziò gli esperimenti che l’avrebbero portata alla scoperta del fenomeno delle trasposizione: le sue fondamentali osservazioni non furono allora adeguatamente apprezzate, anche se nel 1952 Brink e R.A. Nilan avevano dimostrato, studiando settori gemelli di spighe di mais possidenti diverse frequenze di mutazioni, che la trasposizione era un fenomeno possibile. Negli stessi anni Peterson isolò un mutante con plantula variegata che si dimostrò poi dipendere da un sistema di trasposizione comune a uno di quelli studiati da McClintock. Nel decennio che seguì, con la scoperta dei geni mobili nei batteri, divenne chiaro che il cambiamento di posizione nel genoma di elementi genetici aveva una funzione critica in molti meccanismi regolativi. Al convegno sulla trasposizione tenuto al Cold Spring Harbor nel 1976, finalmente si riconobbe che il ruolo dei trasposoni del mais si correlava ai fenomeni molecolari studiati nei batteri e in altri microrganismi. Circa venti anni fa è iniziata, con il clonaggio dei trasposoni Ac e Spm, l’era molecolare che avrebbe contribuito a chiarire definitivamente il valore universale della scoperta di McClintock. Peterson, allievo di Rhoades, dal 1956 opera al dipartimento di genetica dell’Iowa State University sviluppando cinquant’anni di ricerca sui trasposoni. Egli ebbe l’opportunità di partecipare con un ruolo primario al clonaggio dell’elemento Spm, quando nel 1977 si associò a H. Saedler, allora a Friburgo e poi a Colonia, dove si sviluppò un scuola molecolare di genetica dei trasposoni cui contribuirono tra gli altri P. Starlinger, F. Salamini, U. Wienand, S. Schwartz-Sommer, A. Gierl.

Genetica della trasposizione. Le acquisizioni sulla trasposizione rappresentano il più significativo contributo del mais alla genetica generale: per alcuni si tratta della più importante scoperta genetica del secolo scorso. La teoria genetica classica negli anni ’40 manteneva con rigore il concetto che l’ordine dei geni nel cromosoma fosse fisso e definitivo, finché McClintock attirò l’attenzione sulle particolari prerogative di alcuni elementi genetici che essa chiamò controlling elements. I suoi studi la indirizzarono inizialmente verso l’effetto inibente che questi elementi esercitano sull’espressione di altri geni, ma subito apparve chiaro, almeno a essa, che questi potevano cambiare posizione nel genoma: quando si inseriscono a un locus generano alleli recessivi somaticamente instabili; se l’elemento è exciso, il gene ritorna funzionale e l’elemento può inserirsi a un altro locus. Un sistema di elementi trasponibili può consistere di una unità autosufficiente nella capacità di excisione e trasposizione: in questi casi l’elemento è detto autonomo. È tuttavia frequente che i geni di una pianta siano sotto il controllo di un elemento trasponibile difettoso il quale, pur alterando l’espressione genica al luogo d’inserzione, non è capace di trasporre. Se nel genoma è presente un secondo elemento che fornisce la funzione di excisione, anche gli elementi difettosi sono indotti a lasciare il sito dove risiedono: è il caso dei sistemi composti da un recettore presente nel gene controllato e da un regolatore localizzato in qualche altra parte del genoma. Le relazioni tra recettore e regolatore permettono di raggruppare gli elementi trasponibili in diverse famiglie. Un singolo elemento regolatore, inoltre, può esercitare il suo controllo sull’espressione di più geni simultaneamente se a questi geni sono localizzati recettori appartenenti alla stessa famiglia. Sia gli elementi recettori sia quelli regolatori possono cambiare in modo ereditabile le loro proprietà. Gli alleli originati dall’inserzione di un elemento trasponibile hanno particolari caratteristiche di mutabilità somatica e perciò sono definiti alleli mutabili. Questa mutabilità si esprime, per esempio nell’endosperma di mais caratterizzato da un fenotipo recessivo, come reversione somatica al fenotipo dominante espressa in cloni cellulari occupanti zone discrete dell’endosperma. Quando il gene è sotto il controllo di un recettore di un particolare sistema di elementi trasponibili, in assenza del regolatore, non si osserva variegazione somatica e l’allele mutabile si comporta come un’unità genetica mendeliana. L’excisione di un elemento trasponibile avviene anche nella linea seminale: il fenotipo che si genera possiede una funzionalità spesso simile a quella dell’allele selvatico ed è trasmissibile alle generazioni successive. I trasposoni sono in grado di provocare estesi riarrangiamenti del genoma, incluse duplicazioni, inversioni, traslocazioni e delezioni. La scoperta della trasposizione è stata possibile perché già dagli anni ’30 la genetica del mais aveva reso disponibili diversi marcatori genetici dell’endosperma e particolarmente la serie Wx, Bz, Sh e C, strettamente concatenati sul braccio corto del cromosoma 9. McClintock aveva sviluppato un codice fenotipico dei colori che le permetteva di decifrare eventi genetici a livello cromosomico, come i cicli rottura-fusione-ponte (BFB), sulla base del tipo di variegazione presente nell’endosperma. Nell’estate del 1931 essa incominciò a interessarsi del comportamento delle terminazioni rotte dei cromosomi. Erano gli anni in cui si prevedeva di usare i raggi X per indurre modificazioni ereditabili nel genoma delle piante. McClintock, studiando l’effetto dei raggi X sui cromosomi del mais, poté dimostrare la fusione tra terminazioni cromosomiche rotte. Se la fusione avveniva tra due cromosomi omologhi, entrambi con una terminazione rotta, nella divisione cellulare successiva si formavano cromosomi dicentrici che generavano cicli successivi di rottura, fusione delle terminazioni e formazioni di nuovi ponti dicentrici. Si originavano anche segmenti cromosomici acentrici che potevano essere persi, ottenendosi così cloni cellulari dove alcune funzioni genetiche localizzate su quella parte del cromosoma venivano a mancare. Ciò corrispondeva alla presenza in una pianta o in un suo organo di settori, per esempio, con colori diversi. Considerando questi studi retrospettivamente, nel 1984, McClintock arriva alla conclusione che le cellule possiedono un sistema per riconoscere le terminazioni rotte dei cromosomi, sistema che tende a saldarle oppure a guarirle. Quando le terminazioni rotte si riconoscono e si fondono si può instaurare un ciclo BFB cromosomico. Se durante lo sviluppo della pianta le terminazioni rotte non sono riparate, si possono generare sequenzialmente deficienze genomiche con serie conseguenze per la vitalità della cellula o dell’individuo. Oltre ai cicli BFB di tipo cromosomico, McClintock studiò il comportamento di una singola terminazione rotta. Questa osservazione portò al concetto di ciclo BFB di tipo cromatidico che, a seguito della riproduzione del materiale costituente il cromosoma rotto con formazione di due cromatidi e della successiva fusione delle loro due terminazioni rotte, genera un cromosoma dicentrico. Nella sua Nobel lecture del 1984 McClintock insiste nel sottolineare che in una particolare famiglia derivata da un singolo incrocio coinvolgente, da parte di uno dei genitori, un cromosoma 9 con un’inversione e una condizione genetica di assenza del meccanismo di riparo, ha permesso che i cicli BFB cromatidici continuassero nelle mitosi delle plantule in via di sviluppo nate da semi dell’incrocio. Nell’estate del 1944 essa allevò 450 piante derivanti da tale incrocio e le autofecondò. Quaranta semi di ciascuna progenie furono allevati sui banconi in serra, dove furono osservati moltissimi eventi di variegazione a carico di fattori genetici clorofilliani. Dalle stesse piante furono poi isolati sia i componenti del sistema trasponibile Ac-Ds sia quelli del sistema Spm. Centocinquanta delle piante considerate furono osservate citologicamente e vi furono notati i più svariati disturbi cromosomici. Basilare fu l’osservazione nelle cellule somatiche di una posizione sul braccio corto del cromosoma 9 dove si verificavano frequenti rotture. McClintock ipotizzò che in questa posizione fosse presente un elemento, da lei indicato con il simbolo Ds (Dissociation), in quanto provoca la dissociazione di segmenti cromosomici, con diverse conseguenze a carico del cromosoma 9. Più tardi scoprì che l’elemento Ds era attivo quando era presente un secondo fattore genetico, che fu chiamato Ac (Activator). Uno degli esperimenti di trasposizione realizzati in quegli anni dimostrò che l’elemento Ds poteva muoversi dalla sua posizione sul cromosoma 9 a un’altra intermedia tra i loci C e Sh. Successivi esperimenti mostrarono che l’elemento Ds non solo trasponeva, ma poteva anche inserirsi a un nuovo e ben preciso locus genetico. Già nel 1914 Emerson si era interessato a un caso particolare di variegazione somatica nella pigmentazione del pericarpo e del tutolo del mais. L’instabilità del locus P, che controlla il colore del pericarpo e del tutolo, era dovuta alla presenza di un elemento, indicato come Mp, strettamente associato allo stesso locus. Studi successivi hanno chiarito che questo elemento è del tutto simile, se non identico, all’elemento Ac di McClintock. L’elemento Mp è un elemento autonomo e, come Ac, esercita un effetto dose sulla manifestazione della variegazione: questa è tanto più accentuata quanto maggiore è la presenza di elementi Mp. Un aspetto interessante riguardante questo tipo di variegazione è stato studiato ricorrendo all’analisi dei settori somatici gemelli.

Caratterizzazione molecolare dei trasposoni. I trasposoni del mais clonati hanno caratteristiche strutturali e molecolari simili a quelle di analoghi elementi procariotici o animali: posseggono sequenze invertite e ripetute alle loro terminazioni e generano una duplicazione al sito di inserzione nel DNA. Trasposoni diversi sono raggruppati in famiglie i cui membri possono essere presenti anche in specie di piante differenti. Elemento distintivo della famiglia è una sequenza comune nelle terminazioni: per esempio, il trasposone Spm del mais possiede la sequenza CACTA che si ritrova anche in trasposoni di soia e bocca di leone; la stessa famiglia è caratteristica per generare una duplicazione di tre nucleotidi al sito di inserzione. Il sistema En/Spm era stato isolato indipendentemente da McClintock e da Peterson. Nel caso del secondo ricercatore, dalle piante originatesi da semi irradiati nel test atomico condotto nell’atollo di Bikini fu isolato un allele mutabile del locus Pg (pale green) che controlla il livello di clorofilla nelle foglie del mais. L’allele instabile (pg-m) presenta un fenotipo variegato dove su uno sfondo verde pallido sono presenti strisce di tessuto color verde normale. Il sistema En/Spm è risultato utilissimo nel clonaggio genico in mais e in molte altre specie vegetali, compresa la specie modello Arabidopsis thaliana. Nelle piante esistono copie multiple dello stesso trasposone sia nelle forme difettose sia in quelle molecolarmente complete e cioè in grado di autotrasporsi. Il numero di copie presenti può essere così elevato da costituire frazioni rilevanti del genoma, come nel caso di alcuni retrotrasposoni, elementi trasposti con un meccanismo di copiatura della loro versione trascritta (e cioè di un mRNA) a cui segue una loro inserzione in una nuova posizione del DNA. Poiché i retrotrasposoni, prima copiati e poi traslocati, non sono excisi, si comprende come il loro DNA, accumulandosi nel genoma, possa aumentare fino a rappresentare porzioni anche molto elevate del DNA totale. Gli elementi trasponibili possono integrarsi in qualsiasi regione di un gene, causando con la loro presenza non solo la mancata espressione del gene stesso (mutazioni recessive), ma anche espressioni parziali o sovraespressioni geniche.

Mutanti di mais e studio delle vie metaboliche attive nell’endosperma
Il concetto che ogni gene poteva essere associato a un enzima guadagnò a Beadle e Tatum il riconoscimento del Nobel (i loro esperimenti decisivi si erano svolti su un eucariote inferiore, la muffa Neurospora; tuttavia entrambi i ricercatori avevano fruttuosamente frequentato il mais e la sua genetica). Questo concetto penetrò la comunità scientifica e generò una logica conseguenza: le vie metaboliche possono essere studiate ricorrendo alle mutazioni che interrompono il flusso e l’accumulo dei metaboliti prodotti dagli organi della pianta. Ne derivava come corollario la necessità che le mutazioni fossero prodotte e il loro fenotipo descritto: da qui l’importanza dei centri che a livello nazionale e internazionale si sono dedicati a collezionare mutanti di una specie. In tale contesto il ruolo centrale per il mais va riconosciuto allo Stock Center, inizialmente dislocato alla Cornell University, dove East e Emerson l’avevano fondato nel 1932 in armonia con lo sviluppo della loro scuola. Attorno al 1953 il Centro fu trasferito a Urbana e E.B. Patterson ne accettò la direzione; la responsabilità passò nel 1966 a R. Lambert che rimase attivo fino al 1986, quando Patterson riassunse la direzione. Un fondamentale contributo al mantenimento del legame tra la comunità scientifica del mais e lo Stock Center è stato portato da E.H. Coe attraverso la Maize Genetics Cooperation Newsletter che oggi ha circa 2200 sottoscrittori. Coe, dal 1954 presso l’Università del Missouri, si è dedicato con passione allo studio della via metabolica delle antocianine, dell’eredità extracromosomica, dei ceppi che inducono una elevata frequenza di piante aploidi (queste sottoposte a trattamento con colchicina si diploidizzano e permettono di ottenere linee pure in una sola generazione). Una seconda figura che ha contribuito ad arricchire le collezioni internazionali di mutanti di mais è M.G. Neuffer. Questi all’Università del Missouri sostituì, nel 1955, G.F. Stadler, lo scopritore, nel mais, dell’effetto mutagenico dei raggi X. Neuffer continuò il lavoro di Stadler sull’azione della radiazione e sviluppò protocolli di mutagenesi chimica che gli permisero di arricchire notevolmente la lista dei mutanti. Nella sua vita professionale isolò circa 2500 mutanti recessivi e ne localizzò 706 sui 10 cromosomi del mais. Con Coe mise a punto il metodo della paraffina per trattare il polline con mutageni chimici. Nel 1968 con L. Jones e M.S. Zuber pubblicò I mutanti del mais, una rassegna visiva dei fenotipi mutanti che molto ha aiutato le successive generazioni di genetisti del mais.

Vie metaboliche. Le più abbondanti proteine di riserva del seme di mais appartengono alla classe delle prolamine, proteine solubili in alcool, note con il nome di zeine. I geni che codificano per queste proteine sono stati tra i primi a essere clonati, sia perché la loro genetica era stata in precedenza molto sviluppata sia perché gli RNA messaggeri delle zeine sono tra i più abbondanti nell’endosperma. Si tratta di famiglie multigeniche dove numerosi componenti sono concatenati in tandem a loci situati su almeno 3 cromosomi. Durante lo sviluppo dell’endosperma la sintesi delle zeine è controllata da vari geni i cui mutanti recessivi hanno un fenotipo opaco (o2, fl2, o7, o6, fl3, Mc, De-B30). Uno di questi regolatori (O2) è stato clonato: appartiene al gruppo delle proteine b-zip, che hanno la capacità di legarsi al DNA attivando la trascrizione genica. Nell’ambito delle piante, il gene O2 e il suo prodotto proteico sono stati tra i più studiati, fino a comprendere l’interazione che questo gene ha con lo stato di nutrizione azotata della pianta. L’uso dei mutanti o2 nel miglioramento genetico del mais si connette con la loro capacità di ridurre drasticamente l’accumulo di zeina, a basso valore nutritivo per l’alimentazione umana e degli animali monogastrici in genere. È da sottolineare che la natura del prodotto proteico di questo gene è tale da regolare una batteria di altri geni: perciò è stato ed è difficile per il miglioratore vegetale eliminare alcuni degli effetti collaterali negativi. La genetica della composizione dell’endosperma di mais, esaminata da Nelson, che ha caratterizzato molti dei mutanti influenzanti la sintesi dei carboidrati, è stata decisiva per la possibilità di esplorare le vie metaboliche interessate alla sintesi dell’amido. Le relazioni tra geni ed enzimi oggi chiarite riguardano Miniature1 e invertasi, Shrunken1 e saccarosio sintasi, Shrunken2 e Brittle2 e ADPG-pirofosforilasi, Brittle1 e un trasportatore di membrana, Waxy e UDP glucosio transferasi, Amylose extender e un enzima per l’assemblamento di catene di amido ramificate, Sugary1 e l’enzima che rimuove le catene laterali della molecola di amido. La ricerca in questo settore continua a essere produttiva. Una sorpresa recente è la scoperta che gli enzimi che idrolizzano le catene laterali dell’amido sono importanti per la sintesi dello stesso. Le vie metaboliche che conducono alla sintesi degli antociani sono state oggetto di lunghe ricerche, con il risultato che più di 20 geni strutturali o regolatori sono stati associati a queste vie biosintetiche. Negli anni ’80 i trasposoni permisero di clonare e sequenziare questi geni: emergeva contemporaneamente la struttura del processo di sintesi dei fenil propanoidi. Era evidente qui la necessità di combinare il cammino metabolico con le genetiche derivanti dallo studio dei mutanti. Uno dei geni che, quando è stato studiato a livello molecolare, più ha sollevato interesse tra quelli che controllano la sintesi delle antocianine nel seme, C1, fu isolato a Colonia nel laboratorio di Saedler e la sua sequenza apparve da subito omologa a quella dei proto-oncogeni Myb del pollo. C1 fu uno dei primi geni regolatori clonati. Da questa rassegna risulta chiaro che è impossibile elencare, anche se relativamente al solo endosperma, tutte le vie metaboliche, integrate dalla posizione nelle stesse dei relativi mutanti, che sono attive durante lo sviluppo del mais.

Genetica quantitativa
Nel periodo 1920-1950 negli Stati Uniti gli ibridi di mais avevano sostituito progressivamente le varietà. Si rivolse al tempo attenzione speciale alla selezione di secondo ciclo delle linee pure in uso per preparare gli ibridi. Le linee derivate erano più produttive di quelle di primo ciclo, ma i loro ibridi non sembravano dimostrare questa superiorità. Ciò fu interpretato con il fatto che una porzione consistente del guadagno genetico ottenibile era già stata sfruttata, ma da parte di alcuni si sostenne anche che era necessario sviluppare e valutare nuovi concetti e metodi. Tra gli studiosi più significativi ricordiamo, in uno sviluppo storico, soprattutto G.F. Sprague che operò dal 1924 per il Dipartimento di Agricoltura (USDA), prima presso l’Università dell’Illinois e poi ad Arlington Farm (Virginia). Il suo maggiore contributo ha riguardato lo sviluppo di metodi di selezione per ottenere linee e ibridi superiori. Egli studiò la combinabilità generale e specifica tra linee di mais, l’eredità dei contenuti in olio e proteine, le interazioni nucleo-citoplasma, la selezione ricorrente e la valutazione precoce delle linee pure. Fu tra i primi a indagare l’evoluzione delle popolazioni sintetiche di mais migliorate con la selezione ricorrente: dalla Stiff Stalk Synthetic (SSS), sviluppata in Iowa negli anni ’30 con la sua collaborazione, si sono originate famosissime linee pure, tra le quali B14, B37 e B73. Emergendo l’esigenza di irrobustire i programmi di miglioramento genetico con l’approfondimento delle conoscenze sulla genetica dei caratteri a variabilità continua, una fioritura di studi si verificò a partire dagli ultimi anni ’40. Fondamentali restano gli schemi di incrocio elaborati da R.E. Comstock e H.F. Robinson per interpretare in senso genetico i risultati dell’elaborazione statistica dei dati biometrici ottenuti dai prodotti degli incroci tra linee di mais. Altrettanto importante appare il lavoro di W.L. Brown, il quale studiò l’eterosi del mais nei suoi aspetti citogenetici e nelle implicazioni che per il fenomeno hanno le affinità tra razze e linee pure del Corn Belt. Le razze di mais divennero per lui il principale interesse, particolarmente per i riflessi direttamente applicativi dell’uso di germoplasma esotico, contribuendo anche a chiarire l’origine del tipo di mais più coltivato nel Corn Belt. Dal 1953 attivo presso l’Università del Nebraska, C.O. Gardner realizzò un grande volume di studi sulla genetica quantitativa di mais e sorgo. Egli condusse esperimenti di lungo periodo sull’effetto della selezione ricorrente, producendo modelli genetici per l’analisi dell’eredità dei caratteri a variabilità continua, che correlano la statistica al disegno sperimentale e alla pratica del miglioramento genetico. M.S. Zuber all’Università del Missouri si è dedicato specialmente ai problemi di resistenza della pianta di mais all’allettamento e agli insetti e ha partecipato allo sviluppo dei metodi di valutazione degli ibridi. Altri suoi studi hanno riguardato i mutanti che influenzano la composizione dell’amido e la possibilità di selezionare per basso contenuto in aflatossine nella cariosside. Notevole il contributo da lui offerto all’industria sementiera sviluppando e rilasciando numerose linee pure di mais largamente utilizzate. Tra queste è famosa la linea Mo17 che, con l’incrocio alla linea B73, ha dominato la produzione pubblica e privata di novità varietali negli anni 1970-1990. Forse un ruolo più importante è del settore pubblico nell’assistere lo sviluppo dell’industria del seme di mais è stato svolto da W.A. Russell. Questi ha sviluppato una serie di linee pure largamente utilizzate in tutto il mondo, inclusa la loro conversione al citoplasma maschio-sterilizzante Texas (T). Caratteristica fondamentale della sua scuola è stato di mantenere molto attiva una linea di ricerca di base rivolta a chiarire i meccanismi genetici fondamentali che controllano l’espressione di caratteri di resistenza ai patogeni e agli insetti, nonché le condizioni teoriche e pratiche di selezione entro le quali sviluppare linee pure superiori. Nel 1952, diventato professore all’Iowa State University, con L.H. Penny e Sprague realizzò un programma di miglioramento del mais estremamente produttivo: da questo si originarono le linee B37, B49, B52, B57, B64, B68 e B73, tutte ben note e sfruttate dai costitutori di ibridi. Malgrado i rilevanti risultati teorici e pratici raggiunti, emergeva negli anni ’60 del secolo scorso un certo grado di scetticismo verso la possibilità di usare modelli matematici le cui premesse spesso si adattavano male alla biologia di una specie: per esempio, i modelli non consideravano mutazione, linkage ed epistasi. La scommessa era di controllare se i modelli disponibili fornivano stime dei parametri di una popolazione utili per predire la risposta selettiva e per confrontare diverse metodologie di miglioramento genetico. Era questa la situazione che incontrò A.R. Hallauer quando, dal 1962, si dedicò presso l’Iowa State University alla genetica quantitativa del mais. Dopo otto cicli di selezione la produzione negli incroci tra popolazioni era aumentata mediamente del 6,5% per ciclo. Ancora più importante, l’esperimento dimostrava che era possibile praticare simultaneamente il miglioramento di popolazioni e la produzione di linee e che le stesse linee pure potevano essere utilizzate come tester nella valutazione delle famiglie in selezione, concetto che fu ripreso da molte compagnie private di miglioramento genetico del mais. Il contributo di Hallauer e dei suoi colleghi dell’Iowa State, dimostra che la teoria genetica quantitativa può predire i cambiamenti indotti dalla selezione nei parametri di popolazione, così come offre una stima dell’utilità pratica del lavoro condotto, quando le linee derivate da un ciclo di selezione sono costantemente valutate per il loro valore combinatorio e di uso pratico. Uno studio sul vantaggio nel miglioramento genetico del mais dei materiali rilasciati dall’Iowa State University indica che il 34% delle componenti genetiche degli ibridi commerciali per le zone temperate del mondo ha ascendenti diretti o indiretti da quelle sviluppate presso quella Università. Anche il problema dell’allargamento della base genetica del germoplasma di mais impiegato nei programmi pubblici e privati è stato affrontato da Hallauer applicando schemi di selezione ricorrente per integrare nei gene pools materiali esotici.

Storia del miglioramento genetico

Sviluppo dei mais coltivati
Il mais è da considerarsi più dell’aquila il simbolo degli Stati Uniti. Brown e H.A. Wallace ricordano che decennio dopo decennio il progresso della civilizzazione del Paese, a partire dal 1780, si può misurare dalla spinta all’espansione verso ovest delle terre coltivate a mais. La storia del successo di questa pianta, oggi coltivata negli Stati Uniti su più di 32 milioni di ha, comincia da allora: da un cereale che i nativi allevavano su non più di 20.000 ha. Già un millennio prima dell’era moderna gli indiani americani avevano compiuto il miracolo di trasformare una pianta selvatica come il teosinte in una specie coltivata. L’atteggiamento verso il mais di queste popolazioni era quasi religioso: cure attente si mescolavano a preghiere e pazienza nell’accettare come mandate da Dio quelle mutazioni genetiche che hanno fatto del mais la pianta agraria più profondamente modificata nella sua struttura produttiva. Tutti i tipi di mais che coltiviamo – vitreo, farinoso, dentato, dolce e da scoppio – erano già noti agli indiani. Certamente il mais ha perso, nei nostri tempi, parte della sua dignità d’uso: era solo cibo degli uomini presso i suoi scopritori ed ora, nei paesi industrializzati, rappresenta quasi esclusivamente la base alimentare delle catene di prodotti animali. Oggi è prevalentemente diffuso un mais dentato diverso da quello che gli indiani conoscevano. Il mais moderno deriva infatti dal tipo vitreo coltivato nel nord degli Stati Uniti e da un secondo progenitore, il mais Gourdseed a spighe compatte e corte con molti ranghi, semi profondi e grandi, coltivato dagli indiani della Virginia e delle Caroline. Dall’incrocio tra i due tipi gli americani immigrati dopo la scoperta dell’America hanno sviluppato i mais dentati, molto più vigorosi dei loro genitori. In Pennsylvania, a partire dal 1812, John Lorain riporta le conseguenze positive sulla produzione dei miscugli tra varietà di mais. Egli fa menzione specifica degli effetti produttivi che induce la coltivazione dei due tipi di mais Gourdseed e Northern flint e mette l’accento sulla necessità che le misture varietali siano fatte con giudizio, in modo da accumulare in una sola pianta caratteri derivanti anche da quattro-cinque varietà. Brown e Wallace commentano l’attività di Lorain mettendo in luce la particolare correttezza delle sue posizioni riguardo ai materiali da utilizzare per migliorare il mais e alle metodologie da usare. Lorain era di origine ugonotta: la sua famiglia era passata dalla Francia all’Inghilterra dove egli nacque, ma che lasciò per gli Stati Uniti quasi subito dopo la nascita. Fu agricoltore e scrittore di cose tecniche, attivo contro il mantenimento della schiavitù.

Effetto sulla produzione delle mostre di varietà di mais
Nella seconda metà del XIX secolo, gli incroci tra varietà cominciarono ad essere pianificati. Questa nuova tendenza si affermò presso la stazione di Agricoltura del Michigan che poi diventerà Università statale. Lì nel 1877 furono condotti da W.J. Beal i primi incroci controllati tra varietà per utilizzare a fini produttivi il vigore ibrido delle progenie. Nato nel 1833 in un distretto rurale del Michigan, Beal crebbe con un profondo interesse per la storia naturale. Nel 1862 era ad Harvard dove fu influenzato da due tra i più famosi naturalisti del tempo: A. Gray, botanico, e L. Agassiz, zoologo. Dopo il dottorato ebbe un posto da professore a Chicago, ma quasi subito fece ritorno nel Michigan come professore di botanica e orticoltura al Collegio di agricoltura. A conoscenza del lavoro di Darwin sull’effetto dell’esincrocio, iniziò a condurre esperimenti con le varietà di mais, introducendo il concetto che l’interesse del selezionatore deve rivolgersi sia alla componente femminile di un incrocio, sia a quella maschile. I risultati delle sue prove indicano che gli ibridi erano superiori del 25% alle varietà di partenza. Fu così chiaro che la programmazione di molti incroci permetteva di scegliere i più produttivi e quindi di mantenere per il futuro solo i genitori di questi. Tale metodo faceva intravvedere la possibilità di migliorare nel tempo e costantemente le produzioni di mais. Quando R. Reid traslocò da Cincinnati in una fattoria a Peoria, Illinois, portò con sé una varietà di mais tardiva a seme rossastro chiamata Gordon Hopkins, del tipo Gourdseed, originaria della Virginia. La semina del 1846 fu un po’ tardiva e la maturazione stentata. Nell’anno successivo il seme germinò male e il coltivatore dovette ricorrere a rimpiazzi che fece utilizzando un Northern flint precoce, la varietà Little Yellow. Le due varietà si ibridarono e dalla selezione degli anni successivi condotta dal figlio James risultò una varietà a cariosside gialla e a spighe cilindriche che riassumeva in sé il meglio dell’incrocio Gourdseed x Northern flint, la famosa varietà Reid Yellow. Dopo il 1893, quando vinse un premio alla fiera di Chicago, la varietà iniziò a essere coltivata su larga scala e divenne così il punto di partenza per i cicli di selezione condotti da altri ibridatori che più tardi, nel XX secolo, ne avrebbero estratto importanti linee pure. Un ceppo di Reid Yellow molto particolare fu selezionato da G. Krug dalla combinazione di questa varietà con una seconda coltivata in Iowa, ottenendone elevatissime produzioni in un contesto di grande variabilità intravarietale. Il segreto di Krug era stato di selezionare a favore di un elevato peso specifico: la nuova varietà, che da lui prese il nome, risultò, nell’epoca precedente l’arrivo degli ibridi, la più produttiva. La ricetta di I. Hershey, che era un agricoltore della contea di Lancaster, Pennsylvania, fu di incrociare una varietà tardiva a spiga lunga con una vitrea precoce. La miscela fu arricchita di geni da altre 4 varietà e fu sottoposta a selezione, sviluppando la varietà Lancaster Surecrop, che si distingueva per spiga lunga e resistenza alle malattie, ma era suscettibile all’allettamento. In Illinois la varietà, apprezzata per produttività, fu in seguito largamente usata per estrarne linee pure. P.G. Holden, allievo di Beal, quando arrivò in Illinois nel 1895, subito apprezzò il potenziale della varietà Reid Yellow e contribuì alla sua diffusione. Egli era un curioso sperimentatore, tanto da anticipare East e Shull nell’incrociare tra loro linee pure. Nel 1902 passò a insegnare all’Università dell’Iowa, dove ebbe il merito di sensibilizzare gli agricoltori all’uso di seme eletto. Dal 1900 al 1920 un fenomeno a suo modo insolito si realizzò nella fascia americana del mais (Corn Belt): la fiera delle spighe di mais. Il movimento generò un acuto interesse verso spighe uniformi per lunghezza e tipo di seme. Tuttavia, fino a quando non furono proposti metodi di valutazione basati sulla produzione delle progenie delle spighe, non si fu in grado di apprezzare il vero valore genetico di una spiga presentata alla fiera. Un allievo di Holden, M.L. Mosher, introdusse in Iowa esperimenti triennali di produttività e accertò che le varietà vincitrici non corrispondevano a quelle reputate migliori nelle mostre. Mosher fu il mentore della varietà Krug, allora reputata poco uniforme. Nascevano così le prove comparative varietali. Sempre in Iowa, H.D. Hughes fu decisivo nel diffondere il nuovo concetto e non sorprende che presso quella Università si sviluppasse un gruppo di ricerca genetica che per 100 anni ha fornito idee e metodi al miglioramento del mais.

Ibridi
Brown e Wallace, gli estensori di una storia del mais vista attraverso la vita dei primi studiosi della specie, ritengono che lo sviluppo degli ibridi sia stato, per questa pianta, la più grande scoperta agricola dei tempi moderni: nella cintura del mais nordamericana si coltivavano nel 1988 solo mais ibridi; negli stessi campi nel 1920 erano usate esclusivamente varietà a impollinazione libera. Rispetto alle varietà gli ibridi producevano almeno il 30% in più e, soprattutto, non allettavano rendendo possibile la meccanizzazione totale della coltura. Incrociando tra loro due ibridi semplici, ciascuno ottenuto da due linee pure, si produceva il seme degli ibridi commerciali a quattro vie che, prima del 1960, erano i soli coltivati. Questi sono poi stati sostituiti da incroci a due vie (single cross) e da incroci a tre vie in cui le due linee che originavano il portaseme dell’ibrido finale erano in parte imparentate (incroci semplici modificati). Già Darwin nel suo saggio Effetti dell’impollinazione incrociata e dell’incrocio nel regno vegetale aveva asserito che gli incroci fra varietà e anche tra specie generano progenie superiori, mentre l’inincrocio induce depressione vegetativa. Darwin, nello specifico argomento, si era ispirato ai lavori di vari ricercatori tedeschi e inglesi. W.O Foche in Germania scrisse ampiamente nel 1881 dei benefici dei tipi ibridi producendo un vasto compendio bibliografico sull’argomento e citando anche, caso raro, il lavoro di Mendel. Prima di affermarsi, il controllo a fini applicativi del vigore ibrido doveva però attendere la riscoperta di Mendel e la nascita della genetica. Quando le idee di Mendel furono note a G.H. Shull, i suoi interessi per la botanica e la statistica presero una ben precisa direzione. Shull, allievo di C.B. Davenport, allora rinomato direttore ai laboratori di Cold Spring Harbor, dal 1904 si dedicò allo studio dell’eredità delle piante. Come prima indagine egli analizzò la trasmissione del carattere amilaceo o zuccherino dei semi di mais, sfruttando l’impollinazione artificiale. Fu così che iniziò l’avventura degli ibridi. Influenzato dal danese W. Johannsen, Shull volle controllare se anche nel mais esistessero le cosidette “linee pure”. Per seguire l’ereditarietà del numero di ranghi della spiga disegnò un esperimento che prevedeva il controllo di progenie di spighe autofecondate o incrociate con altro polline. Poi, un caso fortuito, decise di pesare il prodotto delle sue parcelle e scoprì che le piante da seme ibrido producevano il triplo di quelle da seme autofecondato, incontrando così per la prima volta il vigore ibrido. In 4-5 anni Shull aveva decifrato l’effetto dell’inbreeding e dell’esincrocio nel mais e accertato che per le piante allogame l’ottenimento di linee pure necessita di 5-6 generazioni di autofecondazione. Nel 1909 era in grado di descrivere un metodo di miglioramento del mais basato sulle linee pure. Il suo metodo, tuttavia, dovette attendere per l’applicazione il 1917, quando D.F Jones della Stazione agraria del Connecticut propose l’uso pratico del vigore ibrido attraverso la preparazione di ibridi a 4 vie prodotti su portasemi ibridi a due vie molto produttivi. Shull è il fondatore della rivista Genetics e colui che ha coniato il termine “eterosi” per significare il vigore ibrido. Jones, l’ideatore del ricorso agli incroci a 4 vie per sfruttare commercialmente l’eterosi, era allievo di East. Questi aveva iniziato in Illinois i suoi esperimenti di inincrocio per controllare quale fosse la causa della perdita produttiva delle selezioni di mais ad alto contenuto proteico della cariosside. Passato nel Connecticut, East continuò lo studio sull’inbreeding e sull’esincrocio con metodi simili a quelli di Shull e con simili risultati. Un altro personaggio da ricordare è H.A. Wallace che, nato in Iowa, presso quella Università seguì i corsi di agricoltura. Al tempo del dottorato, egli fece sue le critiche alle “fiere delle spighe” e, lavorando con Holden, divenne un assertore delle prove di confronto varietale e intravarietale. Nel 1913 iniziò a sviluppare linee pure di mais, un po’ in ritardo per chi conosceva il lavoro di Shull. Dopo che Jones nel 1917 propose lo sfruttamento pratico di mais ibridi attraverso l’uso di incroci a quattro vie, Wallace si dedicò intensamente per un periodo di 15 anni a promuovere l’uso della nuova tecnologia. Dal 1933 al 1941 fu Segretario all’agricoltura nell’amministrazione Roosevelt. È straordinario constatare che dal piccolo programma di breeding di Wallace nacque la Pioneer Hi-bred International, fondata nel 1926, oggi la più importante produttrice mondiale di seme ibrido di mais. Wallace promosse gli ibridi di mais con passione, tanto che questi, negli Stati Uniti, coltivati sull’1% della superficie a mais nel 1933, dieci anni dopo, lo erano sul 78% e sul 100% nel 1965. L’ibrido di mais ha totalmente cambiato la natura intima dell’agricoltura americana: dalla fattoria famigliare si passò rapidamente verso una forma di azienda industriale che anno dopo anno divenne sempre più estesa in superficie. Si realizzò così nel mondo la prima rivoluzione verde che testimoniava come l’applicazione delle tecnologie genetiche poteva aumentare sensibilmente la produttività dei campi. Il successo degli ibridi in USA si estese all’Europa solo dopo la fine della seconda guerra mondiale.

Miglioramento genetico moderno
Le stime del progresso genetico conseguito dai miglioratori del mais negli ultimi 70 anni dimostrano che nelle aree in cui sono stati adottati in coltura i mais ibridi il guadagno annuale medio in granella prodotta varia tra 65 e 75 kg ha-1. Nel confronto con i primi ibridi coltivati, quelli moderni sono cambiati nel fenotipo: le piante hanno foglie erette, gli stocchi resistono all’allettamento, la senescenza fogliare è dilazionata anche in presenza di una rapida perdita di acqua dalla granella, la pianta produce una spiga di dimensioni cospicue anche quando coltivata a elevata densità. Per resistenza alle avversità biotiche e abiotiche e per efficienza dell’uso dell’azoto, gli ibridi recenti sono sempre risultati superiori ai precedenti. Il motore del miglioramento moderno del mais è direttamente riconducibile a un obiettivo quanto mai semplice: massimizzare l’eterosi. Va notato che se l’eterosi è misurata come differenza fra la produzione di un incrocio semplice e la produzione media delle linee parentali, questo valore non è significativamente aumentato con il progredire dell’attività di miglioramento genetico. Ciò è attribuito al contributo della capacità produttiva delle linee pure che, invece, risulta decisamente accresciuta per sé come risposta al lavoro di selezione. Nella ricerca della massima eterosi emerge una traccia teoricopratica di grande importanza: secondo uno dei fondatori del miglioramento genetico moderno del mais, Sprague, il più importante elemento di un programma di miglioramento consiste nel riconoscimento e nell’uso dei pattern eterotici. Questa acquisizione semplifica e aumenta l’efficienza di tutte le operazioni successive. Una recente rassegna di J.C. Reif, A.R. Hallauer e A.E. Melchinger reitera che i concetti di gruppo eterotico e di pattern eterotico sono fondamentali per il miglioramento genetico del mais. Appare evidente che sarebbe importante, a supporto di questa impostazione così fruttuosa di risultati, poter dare una spiegazione genetica del fenomeno dell’eterosi, ma le teorie proposte finora non sono del tutto sufficienti. Quelle classiche si riferivano: – alla dominanza, e cioè alla complementazione nel fenotipo finale di alleli dominanti favorevoli presenti in modo diverso nelle linee parentali dell’ibrido; – alla sovradominanza, assumendo che l’interazione tra alleli dello stesso locus genetico si possa risolvere in una superiorità della condizione ibrida; – al contributo dovuto all’epistasi e cioè alle interazioni tra alleli di geni diversi nella manifestazione del fenomeno. Con l’avvento della genetica molecolare e della genomica si è riaperta la caccia ai meccanismi che potrebbero determinare l’eterosi. Gli studi condotti con mappe molecolari hanno permesso di assegnare a definiti segmenti cromosomici i fattori genetici (QTL) all’origine della manifestazione eterotica. I dati molecolari e genomici più recenti puntano sull’ipotesi della dominanza in base alla constatazione che una frazione consistente di geni funzionanti è assente in specifiche linee e presente in altre: questo risultato ci riporta a una spiegazione dell’eterosi essenzialmente fondata sulla complementazione genica. Il ricorso ai gruppi di pattern eterotici nel miglioramento genetico del mais permea oggi le attività di campo, sostenute da misure di distanza genetica ottenibili con i marcatori molecolari. La rilevanza di questo approccio s’impose quando la produzione di seme ibrido passò dagli incroci a quattro vie agli incroci semplici. Le linee pure al momento utilizzate per la produzione di ibridi adatti alla zone temperate del mondo possono essere ricondotte, da parte materna, a cicli successivi di selezione delle linee A632, B14, B37 e B73, tutte derivate dalla sintetica SSS che ha, come già spiegato, una base genetica derivante dalla varietà Reid Yellow. I contrapposti parentali maschili oggi in uso hanno i progenitori nelle linee pure C103, Mo17 e Oh43, che almeno in parte derivano dalla varietà Lancaster. Hanno contribuito anche linee Iodent che originano da I159, I198, I205 e MBS847, le quali hanno introdotto nel pool genetico maschile la capacità di perdere umidità della granella a maturazione fisiologica, uno dei fattori di successo di alcuni degli ibridi più moderni. L’assemblamento dei gruppi eterotici può essere condotto secondo modelli diversi. Nel 1967 C.E. Cress propose di sviluppare un programma a lungo termine dove tutto il materiale genetico superiore disponibile fosse interincrociato costituendo una sola popolazione sintetica. Questa popolazione può essere poi campionata utilizzando l’incrocio contro linee pure specifiche creando così sottopopolazioni che rappresentano i diversi gruppi eterotici. Ovviamente l’incrocio tra sottopopolazioni dovrebbe essere tale da massimizzare l’eterosi negli ibridi costituiti tra linee pure estratte dai gruppi. Melchinger e R.R. Gumber, nel 1998, suggeriscono invece di scegliere preliminarmente popolazioni di mais con elevata variabilità genetica e di caratterizzarle in termini di distanze genetiche. Queste aiutano nella scelta di specifiche popolazioni che poi rappresentano i gruppi eterotici capaci, come dettagliato più sopra, di massimizzare la probabilità di estrarre ibridi superiori dagli incroci fra linee pure ottenute da gruppi contrapposti. Una trattazione del miglioramento genetico del mais come si è svolto negli ultimi 60 anni, è stata proposta da Sprague ed Eberhart nel 1977. Le sorgenti da cui ottenere materiale da autofecondare sono state, in senso temporale, le varietà a impollinazione libera, seguite da popolazioni segreganti da reincrocio, da popolazioni segreganti F2, da popolazioni sintetiche e sintetiche più o meno modificate con germoplasma esotico. Il metodo del reincrocio è stato impiegato per i programmi di miglioramento convergente dove, accertata la superiorità di un ibrido a due vie, si migliorano indipendentemente le due linee componenti per aggiungere loro caratteri positivi. Una procedura per accelerare la costituzione di linee pure è stata proposta da S.S. Chase, allora attivo presso la Dekalb, società produttrice di seme ibrido, consiste nell’impiego di materiali genetici che permettono di isolare piante aploidi. Il corredo cromosomico di queste è poi duplicato ottenendosi, in un periodo di tempo relativamente breve, linee pure diploidi. Nella sua versione più recente il metodo sta avendo una notevole applicazione. Oggi si ritiene che la valutazione delle linee pure per se sia efficace per migliorare i caratteri morfologici e di resistenza degli ibridi e che la selezione sia tanto più efficace quanto prima viene applicata durante la fase di autofecondazione. La correlazione tra l’espressione dei caratteri in una linea e nei suoi ibridi è risultata significativa per la profondità del granello, il numero di ranghi, la lunghezza e il diametro della spiga e, in parte, anche per la produzione. L’attitudine combinatoria generale dei materiali in autofecondazione può essere determinata con prove precoci. È stato accertato che l’adattabilità del mais a diversi ambienti pedoclimatici in parte dipende dalla possibilità di allevare popolazioni costituite da un elevato numero di genotipi. Si sono tuttavia ottenuti dati sperimentali sicuri a favore di una elevata stabilità per specifici ibridi semplici che possiedono un’alta produttività. L’individuazione di questi formulati ibridi è una delle chiavi del successo delle società sementiere capaci di mantenere una rete di sperimentazione diffusa in tutto il mondo.

Miglioramento del mais e tecnologie molecolari
Lo sviluppo negli ultimi due decenni della biologia molecolare ha generato e via via migliorato la conoscenza dei geni che controllano l’espressione dei caratteri fenotipici. Questa è comprensibilmente ancora incompleta, ma ha già permesso di intravvedere e in qualche caso sfruttare l’informazione ottenuta per la soluzione di importanti problemi agronomici. Il processo di trasferimento di conoscenze si è poi accentuato quando si sono rese disponibili sequenze complete di genomi delle piante. Oggi il grado di conoscenza dei determinanti genici e genomici alla base della fisiologia delle piante coltivate è tale da rendere possibile un ventaglio molto ampio di applicazioni. Esse si sono fin dall’inizio concentrate su specie di grande coltura per le quali il mercato del seme e i conseguenti ritorni finanziari sono facilmente controllabili, come nel caso del mais e della soia. Non sembra conveniente in questa rassegna ripercorrere le tappe biotecnologiche che hanno permesso di proporre e introdurre in coltivazione ibridi di mais geneticamente modificati (OGM). Esse sono note anche al lettore non specialista della materia, il quale è stato senz’altro esposto volontariamente o involontariamente alla saga mediatica che ha accompagnato in Italia e in Europa i processi di proposta e approvazione di OGM vegetali. L’attuale situazione si riflette in uno stato di moratoria che non permette il loro uso nelle coltivazioni. Appare doveroso fare notare che gli OGM sono coltivati nel mondo su oltre 100 milioni di ettari e una frazione importante di tali colture è occupata dal mais; inoltre non è mai stato dimostrato un caso di un OGM di mais che abbia prodotto danni alla salute dei consumatori. Una seconda applicazione biotecnologica al miglioramento genetico dei vegetali considera l’uso di forme di assistenza molecolare nel processo di selezione di varietà e ibridi superiori. Per esempio, le tecniche di controllo dei trasposoni e del loro movimento introducono un nuovo approccio alla scoperta della funzione dei geni. L’adozione di metodi molecolari nel miglioramento presuppone: – la disponibilità di dense mappe genetico-molecolari, dove i loci marcatori sono rappresentati da polimorfismi del DNA; – l’assegnazione nelle stesse mappe di una posizione ai QTL che controllano i caratteri oggetto di studio; – la fattibilità di clonare i geni responsabili delle differenze alleliche alla base dei QTL. La prima condizione è facilmente soddisfatta dai metodi noti con gli acronimi RFLP, RAPD, SSR, AFLP, oggi in parte sostituiti da tecniche in grado di rilevare i polimorfismi dovuti a differenze rappresentate da un solo nucleotide, polimorfismi indicati con l’acronimo SNP (single nucleotide polymorphism). Gli SNP si rilevano, in confronti casuali fra linee di mais, con frequenze attorno a 1 ogni 100 nucleotidi e si accertano facilmente con analisi robotizzate. La possibilità aperta dai recenti sviluppi delle tecniche di sequenziamento del DNA e di tipizzazione genotipica via marcatori molecolari, rende possibile valutare l’associazione tra geni specifici e un carattere rilevabile fenotipicamente. Questo nuovo paradigma del miglioramento genetico si origina dalla constatazione che alleli di marcatori contigui possono risultare preferenzialmente concatenati (linkage disequilibrium), una situazione che consente di valutare anche la loro associazione con i geni che sostengono un fenotipo particolare in popolazioni naturali o in collezioni di varietà. Il nuovo approccio è praticato in genetica umana ed è importante anche in specie di interesse agrario. Inoltre gli esperimenti di mappatura dei QTL possono essere estesi fino al clonaggio del locus genetico responsabile del QTL. La selezione assistita (MAS) fa anche uso di marcatori che, pur non rivelando polimorfismi al gene responsabile del QTL, sono strettamente concatenati allo stesso e quindi utilizzabili entro popolazioni segreganti per selezionarlo indirettamente. Procedure MAS basate su un numero di marcatori SNP sufficiente per coprire l’intero genoma di una specie, e che fanno uso di chip molecolari o di altri metodi altamente robotizzati, già contribuiscono a trasformare la selezione genetica del mais da un processo empirico a una attività con solide basi predittive.

Contributo italiano alla genetica e al miglioramento genetico del mais

Il mais, rappresentando in Italia la principale coltura per ampie zone di avanzata e intensiva attività agricola, ha ricevuto significativa attenzione per quanto riguarda sistematici interventi di miglioramento genetico, già dagli inizi del XX secolo. Solo più tardi, negli anni ’50, prendono avvio gli studi di genetica che rapidamente vengono ad assumere, per merito della scuola di A. Bianchi, una posizione preminente nell’ambito delle ricerche sull’ereditarietà delle piante. Oggi, malgrado l’attenuarsi dello stimolo derivante dalla produzione sementiera, ormai quasi del tutto dipendente dall’estero, l’interesse dei ricercatori per il mais rimane vivo e continua a produrre risultati degni di considerazione.

Miglioramento genetico
Dalle varietà agli ibridi. La ricerca fra le popolazioni locali dei tipi più produttivi e meglio adattati ai principali ambienti maidicoli rappresenta il primo passo per il miglioramento varietale. Questa attività, avviata in varie regioni italiane, ebbe il suo centro più attivo nella Stazione Sperimentale di Maiscoltura di Bergamo, sotto la direzione di T.V. Zapparoli. Qui si seguirono due indirizzi: – selezione migliorativa per produttività e caratteri qualitativi nell’ambito di varietà locali pregevoli – costituzione di nuove varietà, incrociando tra loro genotipi diversi. Il progresso così ottenuto fu ragguardevole, anche se ci si rendeva conto che successi produttivi maggiori si sarebbero raggiunti se ci si fosse rivolti verso l’adozione di ibridi secondo le indicazioni provenienti dagli Stati Uniti. Alla fine della seconda guerra mondiale, la Stazione di Maiscoltura, al tempo diretta da L. Fenaroli, si impegnò nell’opera di sperimentazione e di divulgazione di ibridi importati dall’America. Si avviarono pure, con la partecipazione degli Istituti di Agronomia di Bologna e Perugia e dell’Istutito di Genetica per la Cerealicoltura di Roma, programmi di selezione di linee dalle varietà italiane per la formulazione di ibridi vitrei e semivitrei ritenuti allora più adatti alla nostra agricoltura e al relativo mercato. In questa seconda direzione, ma con maggiore riguardo ai materiali moderni di origine statunitense, si collocano i lavori impostati da F. Salamini, che nel 1975 succede a Fenaroli. Nel frattempo la coltivazione degli ibridi si era affermata e copriva ormai più dell’80% della superficie maidicola nazionale.

Gruppi eterotici e popolazioni sintetiche. Il programma di Salamini, cui si affiancano M. Bertolini, A. Verderio e M. Motto, si propone lo sviluppo di materiali di base da fornire alle imprese sementiere operanti nella Valle Padana. Fondamentale, in questo quadro, risulta il riconoscimento dei gruppi eterotici nei quali devono inserirsi le popolazioni oggetto di selezione e le linee da esse estratte. I materiali elaborati si attribuiscono essenzialmente all’ambito dei gruppi Iowa SSS e Lancaster, già ricordati. Varie popolazioni sintetiche dei due tipi sono state fondate a partire da linee fornite dagli Stati Uniti; altre, più originali come concezione, hanno implicato il coinvolgimento di varietà italiane. Quali scopi specifici delle diverse costituzioni si consideravano, oltre all’adattamento agli ambienti italiani, la lunghezza del ciclo produttivo, la resistenza alla piralide e alle virosi. Obiettivo di particolari popolazioni era l’accrescimento del valore nutrizionale delle proteine di riserva, mediante l’impiego del mutante o2 e l’accumulo, con la selezione, di geni modificatori che conferissero compattezza alla struttura dell’endosperma. Il miglioramento delle sintetiche si sviluppa attraverso diverse procedure di selezione ricorrente. All’impostazione di questo tipo di programmi hanno contribuito anche E. Ottaviano e A. Camussi a Milano, C. Lorenzoni a Piacenza, S. Conti e P. Landi a Bologna.

 

Ottenimento di linee pure. Come fase preparatoria alla costituzione delle sintetiche, ma anche in vista di un immediato impiego nella formulazione di ibridi coltivabili in Italia, si operò, negli anni ’70, una vasta raccolta di linee pubbliche, per lo più fornite da istituzioni degli Stati Uniti. Con queste si avviarono esperimenti di valutazione dell’attitudine combinatoria che, successivamente, implicarono anche le nuove linee ricavate dai programmi sviluppati in loco. Oltre alle sintetiche sopra accennate, come fonti di linee si impiegano popolazioni segreganti F2 nelle quali i progenitori sono rappresentati da linee di pregio e dagli ibridi commerciali più moderni per impostazione e produttivi. Questa procedura si è dimostrata particolarmente efficace per estrarre linee con caratteri speciali, riguardanti la composizione delle proteine o dell’amido del seme (o2, wx, ae: Bertolini, Lorenzoni). Varie linee, con buone caratteristiche agronomiche ed elevata attitudine combinatoria, sono state rilasciate per l’impiego da parte dell’industria sementiera e alcune di esse hanno conosciuto un successo significativo.

Risorse genetiche. Immediatamente, al primo diffondersi della coltivazione degli ibridi, ci si rese conto dell’esigenza di preservare il patrimonio di variabilità genetica rappresentato dalle varietà tradizionali. Sull’esempio di quanto avviato nelle Americhe, la Stazione di Maiscoltura, a partire dal 1954, organizzò una sistematica raccolta di popolazioni locali, rappresentative dei materiali allora coltivati nelle diverse regioni. Le accessioni furono oggetto di accurate analisi morfologiche (A. Brandolini) e citogenetiche (Bianchi e collaboratori) che consentirono poi una solida descrizione tassonomica (A. e A. Brandolini, Camussi). La stazione di Bergamo, oggi Sezione dell’Istituto sperimentale per la Cerealicoltura del CRA, conserva con le opportune modalità oltre 600 delle varietà italiane raccolte, cui si aggiungono quasi altrettante popolazioni locali di paesi diversi per lo più europei e mediterranei. Si mantiene inoltre un cospicuo numero di popolazioni sintetiche, pool genetici e linee (circa 3000 entrate in tutto) in parte di costituzione italiana e in parte fornite da enti stranieri.

Genetica
Genetica formale e citogenetica. Si deve a Bianchi, allora alla Facoltà di Agraria di Piacenza, se, a partire dagli anni ’50, fiorirono le ricerche intese a raccogliere, descrivere come effetti morfologici ed ereditari e collocare nelle mappe mutanti della pianta e del seme di mais. I mutanti erano isolati dalle popolazioni locali e indotti con trattamenti mutageni. Parallelamente si svilupparono gli studi di citologia per caratterizzare, attraverso particolarità e anomalie cromosomiche, varietà e linee. Bianchi era convinto che l’analisi dei caratteri secondo il metodo mendeliano dovesse restare alla base delle indagini genetiche sia per la conoscenza dei fenomeni ereditari sia per le applicazioni nel miglioramento. Questa impostazione, ovviamente con gli aggiornamenti che le nuove acquisizioni tecnologiche suggerivano, è stata seguita dai suoi allievi ricordati sopra e da altri come G. Gavazzi e Motto.

Sviluppi biochimici e molecolari. Fra le tematiche specifiche, particolarmente proficua è stata la linea di lavoro che, partendo dall’accertamento del valore nutrizionale dei mutanti o2, ha approfondito le indagini sulle proprietà chimiche delle proteine appartenenti alla frazione zeinica e sui geni che le codificano. Si sono chiariti, inoltre, i meccanismi di controllo della sintesi delle singole zeine. Interessante la funzione della proteina b-32 che, scoperta come uno dei possibili regolatori della sintesi delle proteine di riserva, ha rivelato un’azione difensiva nei riguardi dei patogeni. Per l’impegno in questo settore, accanto a Salamini e Motto, vanno ricordati N. Di Fonzo, C. Soave, A. Viotti e numerosi ricercatori dell’Istituto sperimentale per la Cerealicoltura e dell’Istituto per le biosintesi vegetali del CNR a Milano. Gavazzi, con Tonelli, Racchi, Consonni, all’Università di Milano, segue il filone della biosintesi dei flavonoidi e della sua complessa rete di regolazione, in cui interagiscono fattori genetici e ambientali. Sempre a Milano, Ottaviano e Mari Gorla hanno esaminato il determinismo genetico della funzionalità del gametofita maschile mettendone in evidenza le basi poligeniche e le interazioni con l’ambiente. A iniziare dalla definizione al microscopio elettronico della morfologia delle cere che ricoprono la superficie fogliare nelle plantule dei mutanti glossy (gl), Bianchi e Salamini, con il decisivo apporto di G. Bianchi, hanno caratterizzato sotto l’aspetto biochimico l’effetto dei diversi geni Gl esistenti nel mais e ricostruito la via biosintetica delle cere epicuticolari di questa specie. Un sistema di transposoni (la famiglia Bg-rbg) è stato rilevato da Salamini come responsabile di instabilità al gene O2: in collaborazione con Motto e Hartings, sono stati precisati nel loro funzionamento e nella struttura molecolare sia l’elemento autonomo Bg sia i recettori rbg.

Genetica quantitativa. L’applicazione dei metodi di analisi statistica dei caratteri a variabilità continua prende avvio, negli anni ’50, con R.E. Scossiroli, che allora operava presso la Stazione di Maiscoltura. Diversi ricercatori ripresero questa strada (Conti, Landi, Lorenzoni, Maggiore, Motto) soprattutto allo scopo di valutare le potenzialità delle popolazioni e delle linee che si venivano selezionando. Fra essi spicca Ottaviano che, analizzando la variabilità disponibile per caratteri agronomici della granella e della pianta intera, approfondì anche aspetti teorici della metodologia, in ciò seguito da Camussi. Come necessario elemento da collegare alle acquisizioni genetiche, si studiano i comportamenti fisiologici che sostengono l’espressione dei caratteri di interesse e in primo luogo della produttività. La possibilità di dissezione delle basi genetiche dei caratteri quantitativi mediante le tecniche molecolari ha avuto larga accoglienza, soprattutto a Bergamo e a Milano. Queste tecniche sono state applicate sia per la caratterizzazione dei materiali (varietà e linee) e la loro collocazione in gruppi eterotici sia per identificare QTL, interessando caratteristiche di resistenza alle avversità o di qualità del prodotto. Anche le interpretazioni dell’eterosi sono portate a livello biochimico e molecolare. Tra i contributi più significativi della ricerca italiana al riguardo, si segnala il lavoro di Morgante, a Udine, sul livello di differenziamento dei genotipi in termini di polimorfismi del DNA. Confrontando l’intero genoma di linee quali B73 e Mo17, Morgante ha dimostrato un’altissima incidenza, sul DNA totale, di sequenze del tipo trasposoni non autonomi che sembra generino in continuazione variabilità nella localizzazione e nella funzionalità dei geni e introducano, quindi, piccole, ma numerose differenze fra genotipi. Ciò getta luce sulle basi dell’evoluzione dei genomi entro specie e offre argomento di riflessione sui fenomeni di interazione inter- e intra-genica che possono essere coinvolti nell’espressione dell’eterosi.

Attività editoriale: Maydica. Fra i meriti di Fenaroli si deve ricordare la fondazione, a Bergamo nel 1955, della rivista Maydica definita di “tecnica e divulgazione maidicola”. Lo scopo iniziale era la diffusione in Italia dei risultati sperimentali relativi al miglioramento della coltura maidicola, ma con l’affermarsi di altre fonti di aggiornamento per i tecnici agricoli, gradualmente si accentuò il carattere scientifico e non localistico degli articoli pubblicati. Una svolta decisiva fu impressa nel 1975 da Bianchi che, assunta la direzione insieme a Peterson, introdusse l’inglese come unica lingua ammessa e istituì un comitato di redazione internazionale. In seguito a queste decisioni i contributi dall’estero divennero subito numerosi e altamente qualificati. Oggi Maydica, unica rivista al mondo dedicata esclusivamente agli studi su mais e specie affini, gode di un grande prestigio presso i ricercatori impegnati nella genetica e nel miglioramento genetico del mais.


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