Volume: il riso

Sezione: ricerca

Capitolo: miglioramento genetico

Autori: Elisabetta Lupotto, Stefano Cavigliolo, Pietro Piffanelli

Introduzione

Il riso nutre più della metà della popolazione mondiale costituendo di fatto l’unica sorgente di calorie per alcune aree geografiche del mondo. Nei prossimi 50 anni ci si attende che la popolazione mondiale cresca di circa un terzo e di questo la maggior parte sarà nei Paesi del Sud-Est asiatico, dove già la maggioranza della popolazione soffre di carenze alimentari. Vi sarà quindi bisogno di moltiplicare significativamente la produzione di riso e di grano per il fabbisogno alimentare umano, con un livello di efficienza superiore a quello avuto sino a ora. Purtroppo, nonostante il progredire continuo del miglioramento genetico classico, nell’ultima decade si è riscontrata una situazione quasi di stallo per quanto riguarda l’aumento di produttività di alcune specie tra le più importanti nell’alimentazione umana. Il riconoscimento delle limitazioni imposte dal miglioramento genetico classico ha portato all’evoluzione di una serie di tecnologie avanzate, note globalmente con il termine di biotecnologie, volte da un lato alla realizzazione di cultivar arricchite da geni alieni, conferenti caratteristiche preziose sia qualitative sia di resistenza, dall’altro allo sviluppo di conoscenze sempre più approfondite sul genoma. Parlare oggi di miglioramento genetico del riso significa affrontare l’argomento con una gran varietà di approcci diversi che vanno dalla genetica convenzionale, alle biotecnologie e alla genomica e post-genomica, dove il recente sequenziamento dell’intero genoma delle due sottospecie indica e japonica ha dato sicuramente origine a una nuova era del miglioramento genetico. Il riso è una specie estremamente variabile nei caratteri ed è attualmente coltivato un po’ dovunque nel mondo, tra il 55° N in Cina e il 36° S in Cile. Sin dalla dinastia Han, in Cina venivano distinti due gruppi varietali: il riso Hsien e il riso Keng; essi corrispondono alle due sottospecie japonica e indica, successivamente classificate. Alcuni autori parlano anche della sottospecie javanica, ma le attuali conoscenze genetiche includono la javanica nella japonica, indicando nella japonica vera il tipo delle aree temperate, mentre la javanica viene considerata un tipo di japonica per le zone tropicali. Attualmente entrambe le sottospecie japonica e indica sono presenti nel mondo con una cospicua serie di cultivar, dalle caratteristiche più rispondenti alle richieste dei produttori e dei consumatori, e il metodo di coltivazione più diffuso e più produttivo è senza dubbio quello della sommersione (circa il 55%), cui segue un 25% di riso irrigato dalla pioggia, un 12% di riso in asciutta e un 8% di riso flottante. A fronte degli attuali 600 milioni circa di tonnellate di risone prodotto nel mondo, si stima che entro il 2025 essi debbano crescere fino ad almeno 850 milioni. Di conseguenza, lo sviluppo di nuove varietà più produttive, e dalle caratteristiche più consone a una coltura meno costosa e bisognosa dell’intervento umano, rappresenta una priorità fondamentale nel campo della ricerca. In generale, il processo di domesticazione determinò in O. sativa l’accumulo di modificazioni positive a carico di caratteri primari: numero di foglie, numero di ramificazioni secondarie della pannocchia, peso del granello, capacità di accestimento, velocità di crescita della plantula e delle foglie, sincronizzazione nello sviluppo delle pannocchie, capacità fotosintetica e durata del tempo di riempimento del granello. Contemporaneamente si ebbe la perdita di caratteri ancestrali, quali la pigmentazione del pericarpo, l’aristatura, la dormienza, la crodatura, la sensibilità al fotoperiodo, la fecondazione naturale incrociata. Dove il riso venne coltivato in terreni drenanti, si diversificarono i genotipi upland caratterizzati da precocità, ridotto accestimento, apparato radicale molto sviluppato. Oggi i risi upland vengono correntemente introdotti nei programmi di miglioramento genetico in Cina, dove si sviluppano varietà che possono tollerare situazioni di carenza idrica, e rappresentano una notevole risorsa nel miglioramento genetico delle moderne varietà. Il differenziamento genetico avvenuto in parallelo al processo di diversificazione ecogeografica ha portato alla formazione di barriere di sterilità tra genotipi della stessa specie provenienti da aree diverse; un esempio di incompatibilità deriva dalla sterilità degli incroci tra genotipi appartenenti alle due ssp. japonica e indica. Nella storia della coltivazione del riso, come per molte altre specie, la selezione varietale veniva effettuata empiricamente dagli agricoltori, così da assicurare la continua disponibilità di razze nuove, con caratteristiche migliorate, o semplicemente più resistenti a stress di natura biotica e abiotica. Nella storia del riso, grande importanza ebbero i movimenti del seme, dovuti a migrazioni di popoli, a commercio, a viaggi verso l’Estremo Oriente. Solo molto recentemente si è iniziato a migliorare le varietà mediante incrocio e selezione, per la realizzazione di genotipi con caratteri interessanti derivati da varietà provenienti da altre zone di coltivazione. Proprio in funzione dell’importanza del riso come fonte di nutrimento principale, nelle aree risicole del mondo esso seguì strade di miglioramento genetico diverse, per soddisfare sia il coltivatore e le condizioni colturali specifiche, sia il consumatore e le sue tradizioni. In molte aree, la selezione dalle popolazioni locali portò alla costituzione di varietà fortemente adattate ad ambienti specifici, risorsa genetica importante per il recupero di germoplasma caratterizzato da produttività e resistenze.

Ricerca internazionale

In funzione delle esigenze colturali e di mercato nel mondo, durante il secolo scorso furono fondati e si svilupparono grandi centri di ricerca, localizzati nelle aree che più dipendevano dallo sviluppo della ricerca per la produzione di riso che, come detto, è strettamente influenzata dalle condizioni geografiche di coltivazione. L’attività di queste grandi istituzioni si basa sullo sviluppo della ricerca genetica in senso lato, dalla raccolta delle risorse genetiche allo sviluppo delle tecniche colturali fino alla ricerca più avanzata basata sulle discipline molecolari e sulla genomica. Non deve essere trascurata inoltre l’importanza che queste istituzioni hanno come presenza territoriale in aiuto allo sviluppo della coltura del riso nel Paese, e come centri per la didattica e la formazione. In questa sede invece si cercherà di fornire un panorama di insieme sullo sviluppo del miglioramento genetico fondamentalmente iniziato e sviluppatosi nel secolo scorso nei vari punti strategici per il miglioramento genetico di questa specie. Partendo dalla zona temperata, dove la ssp. japonica costituisce la fonte principale di germoplasma, il Giappone è il Paese che iniziò attorno al 1927 un’attività di miglioramento genetico del riso mirata alla costituzione di varietà adattate a diversi ambienti, rispondenti a elevate concimazioni, resistenti agli attacchi di malattie fungine (Pyricularia grisea), batteriche (Xanthomonas campestris pv. oryzae) e virali, tolleranti restrizioni di natura pedoclimatica come il freddo e la composizione dei suoli. Venivano prese in considerazione anche le caratteristiche qualitative del granello in accordo alle richieste del mercato e dei consumatori locali, linea di ricerca a oggi predominante. La ricerca genetica convenzionale è oggi affiancata dalle nuove tecnologie molecolari. Il Centro di Ricerca per le Biotecnologie di Iwata sviluppa studi di biologia molecolare sull’interazione pianta-patogeno, identificazione di geni di difesa, mappatura e clonaggio di geni di interesse agronomico e mappatura di loci genetici complessi per tratti quantitativi (QTLs). La Repubblica Popolare Cinese sviluppa programmi di miglioramento genetico su entrambe le ssp. japonica (aree nel nord della Cina) e indica nella parte meridionale. Inizialmente l’attività di miglioramento portò alla selezione di varietà di tipo japonica da introduzioni giapponesi di germoplasma nell’isola di Formosa, i cosidetti tipi ponlai. Questi erano caratterizzati da elevata produttività, resistenza alla Pyricularia, precocità del ciclo e insensibilità a termo- e fotoperiodo, potendo essere coltivati anche a elevate latitudini. Gli anni recenti hanno visto l’attività di miglioramento genetico della Cina espandersi considerevolmente: dalla costituzione delle supervarietà, all’impiego degli ibridi, delle biotecnologie, e allo sviluppo dei risi New Plant Type, dove si sommano gli interventi della genetica convenzionale alle modificazioni genetiche Ogm. Menzione particolare deve esser fatta dello sviluppo dei programmi di miglioramento genetico all’Upland Rice Research Centre della China Agricultural University, per la costituzione di varietà produttive in condizione di terreno privo di sommersione (aerobic rice), mediante incrocio e selezione tra varietà tradizionali e risi upland. La tematica è anche oggetto di programmi di collaborazione internazionale tra Cina e Australia, con lo scopo della costituzione di varietà di riso con coltura in asciutta e resistente al freddo. L’Australia possiede una rete di ricerca sul riso sostenuta dal Governo e strettamente correlata alle necessità dell’industria, la RIRDC (Rural Industries Research & Development Corporations, che ha come maggiori obiettivi lo sviluppo di varietà competitive per il mercato, con tolleranza a stress biotici e abiotici, con maggior interesse sulla resistenza al freddo nelle prime fasi dello sviluppo della pianta. Dall’altro capo del mondo, nell’America del Nord, l’attività di miglioramento genetico partì con l’inizio del XX secolo nella Stazione di Crowley in Louisiana. Stazioni sperimentali della rete USDA-ARS anche in altri Stati risicoli (Arkansas, California, Texas) si svilupparono verso la costituzione di varietà diversificate per tipologia di granello, lunghezza del ciclo, tolleranza al freddo, ma con predominanza di alcune caratteristiche quali la taglia bassa, il portamento compatto, la foglia eretta e la resistenza a Pyricularia. Notevole è il contributo dato dall’Unità di Ricerca di Beaumont (Texas) per lo sviluppo di varietà caratterizzate da geni di resistenza ad ampio spettro alla Pyricularia (geni Pi). L’importanza del riso come coltura agraria è sottolineata dalla presenza – anche in Europa – di centri di ricerca dedicati al riso, dei quali il più importante è il CIRAD (Centro Internazionale di Ricerca e sviluppo in Agricoltura) di Montpellier (F), corrispondente dell’IRRI per la banca del germoplasma di riso (www.cirad.fr). In Italia sono due le organizzazioni che si occupano di ricerca sul riso: l’Ente Nazionale Risi (www.enterisi.it) e il Ministero dell’Agricoltura, che contribuì alla fondazione della Stazione sperimentale di risicoltura all’inizio del XX secolo quale principale ente di ricerca per il miglioramento genetico del riso italiano, ora Unità di Ricerca per la Risicoltura del CRA (Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura) (www.entecra.it). Verso il 1940 iniziarono i programmi di miglioramento genetico considerando incroci tra le due ssp. indica e japonica. Sotto gli auspici della FAO, fu iniziata successivamente un’attività di collaborazione internazionale alla quale partecipavano Paesi dell’Asia tropicale, per uno studio coordinato al fine del miglioramento della potenzialità genetica del riso: tale programma rappresentò il primo vero impegno di collaborazione internazionale focalizzato sul riso. In questo ambito si svilupparono gli studi sulla correlazione fenotipo-produttività della pianta, con l’individuazione delle caratteristiche morfologiche determinanti per l’incremento della potenzialità genetica della produzione, dove l’introduzione del gene sd-1 per la taglia bassa costituì – come per altre specie – la rivoluzione verde del riso. Ma l’intervento prioritario nella storia del miglioramento genetico del riso nel mondo è dovuto alla nascita e allo sviluppo dell’attività dell’International Rice Research Centre (IRRI) nelle Filippine. Nato nel 1960 a opera della Ford and Rockefeller Foundation, in cooperazione con il governo di Manila, è situato a 60 km a sud della capitale, presso il campus universitario di Los Banos, e comprende una struttura complessa per la ricerca, la didattica e la logistica, e un’azienda sperimentale di circa 250 ettari. L’IRRI è un’organizzazione di ricerca autonoma e conta su uno staff costituito da 14 Paesi di Asia e Africa; la sua missione prioritaria è rappresentata dalla ricerca per l’aiuto ai Paesi poveri del mondo, per assicurare una produzione di riso sostenibile e disponibile a tutti. L’attività di ricerca, sperimentazione e formazione si svolge in stretta collaborazione con tutti i Paesi produttori di riso, basando la sua presenza capillare su di un sistema di contatto attraverso le istituzioni locali. Aspetti specifici del miglioramento genetico operato dall’IRRI su riso spaziano in tutti gli aspetti connessi alla coltura: risorse genetiche, tecniche colturali, programmi di incrocio, introgressione di geni da specie selvatiche, ricerche sul riso ibrido, selezione ricorrente per l’accumulo di geni favorevoli per caratteri quantitativi (QTLs), coltura in vitro e trasformazione genetica per l’introgressione di geni alieni per caratteristiche di resistenza, fino alla applicazione della selezione assistita con marcatori molecolari (MAB, Molecular Assisted Breeding). Le varietà sviluppate dall’IRRI hanno dato una svolta alla coltura del riso nelle aree del SudEst asiatico: esse sono diffuse e coltivate in tutte le aree risicole e vengono utilizzate come parentali donatori di caratteristiche élite nei programmi di miglioramento genetico della specie.

Miglioramento genetico in Italia

La risicoltura italiana ha sempre avuto come esigenza prioritaria la disponibilità di nuove varietà più rispondenti alle richieste sia colturali sia del mercato. Le ragioni che nel corso degli anni hanno determinato questa necessità hanno riguardato soprattutto l’incremento della capacità produttiva, la resistenza alle malattie (in particolar modo al brusone), la riduzione della durata del ciclo colturale, la riduzione della taglia (per migliorare il comportamento nei confronti dell’allettamento) e più recentemente gli aspetti merceologici e qualitativi del prodotto. Il miglioramento genetico del riso in Italia ha una storia molto ben definita e ricca di eventi. Il suo sviluppo, dalla fine del XIX secolo a oggi, ha portato alla costituzione di numerosissime varietà, molte delle quali – costituite nel secolo scorso – sono ancora oggi coltivate e sono divenute simbolo della produzione nazionale. Oltre alla coltura nel nostro Paese, le varietà italiane sono apprezzate e coltivate dagli altri Paesi risicoli dell’area Mediterranea: Francia, Spagna, Portogallo, Grecia. La coltura del riso, iniziata probabilmente con le incursioni arabe in Sicilia nell’VIII secolo, ma realizzatasi con documentazione storica nelle aree della Pianura Padana verso la fine del XIV secolo, si è avvalsa delle fonti di germoplasma provenienti dall’area temperata orientale, dove la ssp. japonica costituisce il background genetico prioritario. Nei primi tre secoli di vita, la risicoltura italiana non conobbe distinzione di varietà: per lungo tempo venne coltivata una popolazione di forme diverse nota con il nome di Nostrale. Il periodo storico a cavallo tra la fine dell’800 e i primi decenni del ’900 può essere considerato a ragion di logica una fase storica nell’evoluzione della nostra risicoltura. Le ricerche e le attività intraprese in quegli anni sono risultate determinanti segnando una vera e propria spinta propulsiva in questo particolare settore della nostra agricoltura. I risultati ottenuti nel campo della costituzione varietale hanno di fatto aperto la strada al miglioramento genetico del riso nel nostro Paese. Tra le molteplici attività inerenti il miglioramento genetico del riso, senza dubbio la pratica dell’importazione di varietà dai Paesi esteri ha rappresentato la prima via a essere esplorata. A indirizzare il miglioramento genetico in questo senso, furono fondamentali, nella prima metà del XIX secolo, le epidemie di brusone, causato dal fungo Pyricularia grisea (oryzae). Per riparare al preoccupante flagello, i tecnici, gli agricoltori, gli organismi provinciali e lo stesso Ministero dell’Agricoltura compresero la necessità di importare e tentare di acclimatare nuovi risi dall’Oriente che fossero di aiuto per l’Italia. Iniziò così l’importazione di risi robusti, dotati di capacità di resistenza al brusone e in genere dotati di quei requisiti richiesti dalla coltura intensiva e dal mercato che lentamente andava aumentando d’importanza. L’enorme lavoro che seguì, e che portò all’introduzione di numerosissimi genotipi provenienti dai diversi Paesi in cui la risicoltura era diffusa, contrassegnò il XIX secolo con il termine di “secolo delle varietà”. La selezione massale, operata su tali introduzioni, portò all’identificazione di nuove “razze”, prima fra tutte il Bertone, noto come padre delle varietà di riso italiano in quanto prima vera fonte di resistenza al flagello del brusone, che risollevò le sorti della risicoltura nazionale. Le importazioni che seguirono interessarono numerosi Paesi, Giappone, Cina, Stati Uniti, Egitto, ma le numerose introduzioni si rivelarono poco adatte ai nostri climi. Curioso risulta inoltre il tentativo condotto già a quel tempo di importare varietà di riso adatte a crescere in condizioni di assenza di sommersione (la stessa tipologia che oggi viene indicata con il termine di aerobic rice), come rimedio ai problemi legati alla diffusione della malaria. Oggi gli studi in questo senso procedono guidati dalle esigenze di risparmio idrico e miglior gestione della risorsa in agricoltura. L’inizio del XX secolo fu caratterizzato da un’intensa attività congressuale sul riso. Il primo della serie fu il Congresso Risicolo di Novara nel 1901, seguito da quello di Mortara nel 1903. Qui venne dato un elenco di 41 razze di riso coltivate in Italia, completato nel 1905 a 44 razze. In questo elenco comparve per la prima volta il Chinese Originario, pietra miliare nella storia della risicoltura italiana. Attorno al 1901 il Chinese Originario era stato importato dal Giappone dal direttore delle Riserie Italiane di Trieste. Il sacco di semente venne diviso tra vari agricoltori i quali ne fecero selezioni personali tra le quali una ebbe particolare fortuna, una selezione effettuata nel 1902 da un risicoltore vercellese che in seguito divenne l’Originario. Questa varietà ebbe vita lunga restando in coltivazione fino alla fine degli anni ’60, con superfici mai più raggiunte da altre varietà. Esso contribuì a risollevare le sorti della nostra risicoltura fornendo immediatamente un notevole incremento produttivo: da una produzione media di 24 q/ha nel 1905 si passò a 40 q/ha nel 1915 per arrivare, nel 1929, a 49 q/ha di media; nelle risaie nuove, scrive il Gobbetti, esso poteva arrivare a 55-60 quintali per ettaro. Nel 1912 il Prof. Novelli al Congresso di Vercelli così ricorda l’importanza del Chinese Originario: “Riteniamo di dover mettere in evidenza la provvidenziale importazione fattasi 9 anni fa di una varietà giapponese, che ha segnato nella storia della risicoltura un passo importantissimo per la grande resistenza e la grande produttività che tale varietà ha dimostrato di avere nella maggior parte delle nostre regioni risicole”. Dal Chinese Originario, singoli risicoltori trassero per selezione molte varietà interessanti: nel 1915 il Precoce 6 a ciclo più breve, così come l’Allorio e nel ’27 il Pierrot. Alcuni nomi restarono nella tradizione come il Maratelli, del 1919, e nel 1924 l’Ardito o Balilla, un riso a granello tondo ancora oggi di ampia coltivazione, che forse più di ogni altro mantiene intatta nel tempo la sua elevata capacità produttiva. I Congressi Risicoli Internazionali si susseguirono in quei primi anni del XX secolo: a Pavia nel 1906, a Vercelli nel 1912 e a Valencia in Spagna nel 1914. Le discussioni e gli interrogativi formulati, ai quali non si aveva spesso risposta concreta, e il riconoscimento della necessità di un’istituzione di riferimento che si occupasse in modo specifico dei problemi della risicoltura, portarono alla formulazione, nel Congresso di Mortara del 1903, della proposta di promuovere l’istituzione di una Stazione Risicola. Nel 1907, su proposta formale presentata dal marchese Vincenzo Ricci iniziò l’iter burocratico che portò nell’anno successivo alla fondazione della Stazione sperimentale di risicoltura e delle colture irrigue. La Stazione, alla cui costituzione contribuirono Enti pubblici e privati, ebbe un ruolo determinante nel processo dell’evoluzione varietale del riso italiano e divenne per molto tempo l’istituzione scientifica principale in Italia per il miglioramento genetico del riso. Nel primo decennio di vita della Stazione, alla Direzione si avvicendarono diversi funzionari, dei quali Giovanni Sampietro è forse il più conosciuto perché al suo nome è legato l’inizio della costituzione varietale effettuata per incrocio. Nascono le prime linee di incroci: Americano × Vialone, Americano × Chinese Ostiglia, e vengono iniziati gli incroci con un tipo di riso spontaneo che viene chiamato Nano. Proprio dall’incrocio Vialone × Nano, si orginerà la varietà Vialone Nano, che tanta fortuna ebbe e continua ad avere anche ai giorni nostri. Accanto al settore dei risi derivati dagli incroci artificiali si sviluppa il settore della selezione per linee pure, curato da Riccardo Chiappelli, che lavora soprattutto con la razza americana Lady Wright, importata dalla Stazione sperimentale nel 1925. L’importanza di Lady Wright nella storia della nostra risicoltura è notevole in quanto essa è considerata la madre dei risi italiani a granello lungo e cristallino. Questa razza, caratterizzata da elevata instabilità e continue disgiunzioni, offriva un materiale eccellente per effettuare selezione di linee con caratteristiche diverse. Essa fu la prima varietà a cariosside allungata, detta di tipo Carolina che, a seguito di selezioni e incroci con altre razze, permise la costituzione di una serie di varietà a grana lunga: Sesia e Stirpe 136, Razza 82, Rinaldo Bersani o R.B., Arborio, Razza 77 e, molto più tardi, Baldo. L’evoluzione varietale sin qui descritta si era svolta sotto la spinta della necessità di costituire varietà più produttive alle nostre latitudini, e più resistenti alle limitazioni ambientali – per esempio le basse temperature primaverili – e alle malattie. Il miglioramento genetico attuale tiene in maggiore considerazione, rispetto al passato, la stabilità produttiva, l’adattabilità a situazioni pedoclimatiche differenti e le caratteristiche qualitative del granello che fanno del riso forse una delle specie più differenziate per quanto riguarda la richiesta del consumatore e dell’industria. Il progredire degli studi genetici e le conoscenze approfondite dei geni che sono responsabili della costruzione di un ideotipo di pianta hanno prodotto una serie di varietà caratterizzate da vari tratti di importanza agronomica, a cui attingere nei programmi di incrocio e selezione. Un parziale recupero della precocità in genotipi di elevata capacità produttiva è presente nelle moderne varietà, ottenuto applicando le conoscenze di fisiologia della produzione, nella costruzione di una pianta caratterizzata da foglie strette, culmo rigido, ridotto apparato vegetativo, con elevata efficienza fotosintetica, e con aumentata capacità di utilizzo della risorsa idrica e azotata. Da non tralasciare infine l’importanza sempre crescente che le nuove tecniche di biologia molecolare e dei marcatori per il breeding assistito hanno nell’evoluzione varietale attuale. Alcuni degli aspetti principali che portano alla costituzione delle varietà attuali sono descritti in dettaglio nei paragrafi seguenti.

Metodi nel miglioramento genetico

Il riso costituisce la più importante coltura destinata all’alimentazione umana diretta. Sebbene la coltura sia in pratica ubiquitaria nel mondo, oltre il 92% dell’intero raccolto è ottenuto e consumato nel continente asiatico. Tuttavia, in queste aree di elevato consumo, le produzioni sono ancora basse e il divario tra la potenzialità produttiva delle cultivar e la resa reale è elevatissimo. Analogamente a quanto avviene per altre colture, il riso è meno produttivo nei suoi centri di origine rispetto ad altre aree di coltivazione. Questo fatto sembra dipendere dai fattori ambientali limitanti (stress biotici e abiotici) e alla minore disponibilità ad aggiornare i sistemi colturali e/o introdurre nuove tecniche. Un altro aspetto importante è che le varietà locali sono sovente dotate di un portamento vegetativo più vigoroso con un’elevata capacità competitiva intra e interspecifica. Qualora si intervenisse sulle varietà locali, si dovrebbe tener conto di questa competitività intrinseca da mantenere durante il processo di selezione verso una maggiore produttività. Questo fatto rende il miglioramento genetico del riso nelle zone del Sud-Est asiatico più complesso e difficoltoso di quanto non lo sia per il riso delle aree temperate, soprattutto per le aree risicole occidentali, dove l’intervento dell’agrotecnica rende la situazione colturale ottimale per la pianta. Nelle aree tropicali il miglioramento genetico deve combinare contemporaneamente resistenze a stress di varia natura, mentre negli ambienti più favorevoli con intensità luminosa elevata, dove vengono utilizzate agrotecniche avanzate, il miglioramento genetico può essere rivolto alla resa produttiva, alla resistenza all’allettamento, alla risposta nei confronti della concimazione azotata, alla qualità del granello. L’elevata competizione tra le piante nelle prime generazioni segreganti di un incrocio è uno dei più importanti fattori che influenzano la scelta del metodo di selezione. Nel riso, una quota importante della competizione tra individui è sicuramente quella per la luce, che inizia molto presto nel ciclo di sviluppo della pianta con l’accestimento, e porta gli individui più vigorosi a sottrarre spazio alle piante meno competitive. Queste, risultando più basse e più deboli, acquisiscono caratteristiche agronomicamente indesiderabili. In uno stadio di sviluppo più avanzato può manifestarsi competizione per fattori nutritivi, in particolare per l’azoto. In generale, il miglioramento genetico del riso può avvenire – con modalità convenzionali – attraverso tre strade principali: selezione da popolazioni in disgiunzione, incrocio e selezione e sfruttamento dell’eterosi. Di queste metodiche per lungo tempo è stata applicata la prima, soprattutto a carico delle introgressioni di germoplasma estero durante il periodo di acclimatazione, sostituita in seguito dall’incrocio e selezione e, più recentemente, dall’impiego degli ibridi. Pertanto, il passo iniziale nel miglioramento genetico del riso, come nelle altre specie, è il ricorso all’incrocio (ibridazione artificiale) fra due parentali recanti geni di interesse, al fine di sfruttare la ricombinazione genica per la selezione, nella risultante progenie, di individui dalle caratteristiche superiori.

Ibridazione artificiale
Nei programmi di miglioramento genetico si ricorre alla tecnica di ibridazione controllata (artificiale) con il preciso obiettivo di concentrare all’interno della progenie i geni provenienti da due differenti genitori. Attraverso tale operazione si assiste alla creazione di nuova variabilità su cui poter successivamente operare con la fase di selezione, sfruttando gli eventi di ricombinazione e segregazione a cui vanno incontro i geni a partire dalla generazione F2 e nelle generazioni successive. In questo ambito la disponibilità di tecniche di ibridazione efficienti può di fatto condizionare quelli che sono i tempi per il rilascio di nuovi genotipi. La complessità delle operazioni che si riscontrano nell’esecuzione degli incroci controllati aumenta passando dalle specie dioiche a quelle monoiche e, nell’ambito di queste ultime, tra quelle autoincompatibili a quelle autocompatibili con fiori unisessuali fino a quelle con fiori ermafroditi come appunto il caso specifico del riso. Il riso, così come altri cereali, è considerato una specie a fecondazione prevalentemente autogama in cui però la percentuale di allogamia (ibridazione naturale) può raggiungere in alcune varietà e in condizioni particolari anche il 10%. Oltre ai problemi legati alla biologia riproduttiva degli organi fiorali, l’esecuzione dell’incrocio artificiale può trovare alcune difficoltà anche strettamente di tipo tecnico-pratico dovute per esempio alle ridotte dimensioni delle spighette, difficoltà che possono essere superate grazie all’acquisizione di un buon grado di manualità da parte dell’operatore. Tutte le diverse tecniche di ibridazione si basano essenzialmente sull’emasculazione delle spighette del genitore scelto come portaseme (genitore femminile), eliminando così la situazione di ermafroditismo che caratterizza il fiore del riso. Le fasi temporali in cui si sviluppa la pratica dell’incrocio sono rappresentate da: toelettatura, emasculazione e impollinazione. Tra le tecniche, le maggiori variazioni si riscontrano nella fase relativa all’emasculazione: essa può avvenire per asportazione oppure per devitalizzazione degli organi (antere) o dei gameti maschili (polline). Il metodo, definito classico, applicato per la prima volta in Italia da Sampietro nel 1925, consiste nel tagliare più o meno trasversalmente mediante l’impiego di forbicine una porzione delle glumelle appena al di sopra delle antere, in modo da esporre le medesime senza ricorrere alla divaricazione come invece avviene per il frumento. L’operazione viene condotta solamente sui fiori ritenuti allo stadio ottimale, ovvero che presentino le antere a metà della cavità fiorale quando osservati in controluce. La scelta del momento in cui eseguire l’emasculazione risulta molto importante: se l’operazione viene eseguita troppo anticipatamente il fiore risulta ancora immaturo e può venire compromessa la ricettività dello stigma, mentre se eseguita in ritardo aumenta il rischio di autofecondazione. Dalla pannocchia vengono rimosse le spighette apicali normalmente già fiorite e quelle basali ancora immature. Procedendo in questo modo restano sulla pannocchia circa 40-50 fiori (in funzione delle dimensioni del panicolo) che possono essere così emasculati. L’asportazione delle 6 antere avviene tramite l’impiego di pinzette a punta ricurva, prestando particolare attenzione per non lacerare le pareti delle antere e aumentare così il rischio di autofecondazione. Dopo la castrazione del fiore, le pannocchie operate vengono racchiuse in un sacchetto di carta trasparente al fine di evitare impollinazioni indesiderate. Nel periodo compreso tra alcune ore fino a un massimo di un giorno, viene eseguita l’impollinazione, utilizzando il polline prodotto dal parentale scelto. Le pannocchie vengono prelevate o dalle piante impollinatrici allevate in vaso o viceversa raccolte direttamente in campo. L’impollinazione controllata può avvenire mediante l’utilizzo di polline isolato, antere o pannocchie. Nei primi due casi il polline o le antere vengono raccolti direttamente dalle pannocchie in antesi e successivamente distribuiti sui fiori castrati. In entrambi i casi si tratta di un metodo laborioso adatto perciò per un limitato numero di incroci. Il metodo maggiormente diffuso, perché più rapido e di facile attuazione, risulta invece l’impiego diretto delle pannocchie in fioritura, le quali possono venire inserite direttamente insieme alla pannocchie portaseme nel medesimo sacchetto o viceversa si ricorre allo scuotimento delle stesse al di sopra di quelle precedentemente emasculate. Un secondo metodo di castrazione risulta quello messo a punto nel 1933 da Van der Meulen nel quale, successivamente al taglio delle glumelle, la rimozione degli stami avviene attraverso l’aspirazione mediante una pipetta Pasteur collegata a una pompa da vuoto. Dal 1973 tale metodologia risulta applicata in modo sistematico presso l’IRRI nelle Filippine, dove annualmente vengono realizzate diverse migliaia di ibridazioni. Oltre ai metodi che prevedono la castrazione dei portaseme mediante rimozione delle antere, esistono tecniche alternative che prevedono la devitalizzazione del polline attraverso l’impiego di trattamenti termici, in grado di devitalizzare i granuli pollinici senza ledere la fertilità del gineceo. I trattamenti termici utilizzati si distinguono a seconda che prevedano l’impiego di acqua fredda o calda: quest’ultimo è il più diffuso perché più efficace come agente sterilizzante. Operativamente l’emasculazione si realizza immergendo direttamente la pannocchia in acqua calda contenuta in un apposito recipiente termostatato. Nel caso specifico del riso sono state messe a punto diverse combinazioni tra temperatura utilizzata e tempo impiegato per il trattamento. In generale la combinazione più utilizzata risulta quella che prevede il trattamento della pannocchia con 43-43,5 °C per 4-5 minuti. Dopo il trattamento si realizza l’apertura temporanea dei fiori pronti per essere fecondati, mentre quelli che restano chiusi, perché immaturi o già fecondati, possono essere facilmente individuati e asportati dalla pannocchia. In generale la castrazione mediante l’acqua calda o il vuoto consente una maggiore efficienza in termini di numero di semi ibridi ottenuti nell’unità di tempo rispetto a quella manuale. Di contro quest’ultima non richiede l’uso di una strumentazione particolare e inoltre, se eseguita da personale competente, può fornire ugualmente buoni risultati. È evidente pertanto come la scelta della tecnica di ibridazione più appropriata risulti derivata da una serie di fattori: ambiente in cui si opera, esperienza dell’operatore e numero di incroci che si intende realizzare.

Incrocio e selezione
In generale, i progressi della selezione genetica sono legati alla presenza di variabilità nelle popolazioni disponibili da cui trarre i parentali per l’incrocio iniziale. Questa, a sua volta, è influenzata dalla storia selettiva del germoplasma prevalente nella popolazione. Le specie cereali – e tra queste anche il riso – sono caratterizzate dal possedere una grande variabilità genetica per caratteri morfologici, biochimici e fisiologici. L’impiego pratico di questa variabilità, teso al perfezionamento delle caratteristiche qualitative, produttive e agronomiche, ha permesso l’ottenimento di risultati positivi. Il riso inoltre, che come detto è coltivato in pressoché tutte le aree rurali del mondo, a latitudini molto diverse, esplica nel genere Oryza un’enorme potenzialità genetica. Per citare uno degli esempi più interessanti a questo proposito, si può ricordare la costituzione di varietà di riso NERICA a opera del citato WARDA, istituto di ricerca africano. NERICA deriva da incroci tra O. sativa – da cui prende la produttività – con O. glaberrima, la specie che si è differenziata nel continente africano, dalla quale prende adattabilità all’ambiente di coltivazione, ciclo più breve, tolleranza a stress biotici e abiotici. Oltre a questi caratteri, da O. glaberrima derivano le proprietà organolettiche. La elevata sterilità e le problematiche legate all’incrocio iniziale sono state superate grazie all’intervento della tecnica degli aploidi con la coltura di antere (vedi successivamente); impiegando il backcross su O. sativa, per ridurre gli effetti indesiderabili della maggior parte degli alleli negativi di O. glaberrima, sono state ottenute linee fissate, completamente fertili, contenenti circa il 12% di genoma O. glaberrima nel background di O. sativa. A queste linee iniziali è stato dato il nome di NERICA (New Rice for Africa). Le varietà derivate da questo incrocio interspecifico e migliorate, rilasciate ufficialmente in Costa d’Avorio, Uganda e Nigeria, stanno diffondendosi nell’areale africano con grande successo, sia nelle zone di montagna sia nelle terre irrigate. In alcuni casi i risi NERICA si sono dimostrati superiori in produttività rispetto alle varietà di O. sativa, con gran soddisfazione dell’agricoltura locale.

Metodi di selezione
Tradizionalmente, sia per le aree tropicali sia per quelle temperate, il metodo di selezione adottato per il miglioramento genetico del riso è il bulk. Sebbene di semplice e diffuso impiego, il metodo bulk non è considerato di particolare successo. Infatti, in generale, non si sono ottenuti apprezzabili guadagni nella produttività; sembra che il maggiore svantaggio da esso presentato sia dovuto al forte effetto di competizione nelle generazioni segreganti, cosa che elimina, nelle popolazioni riunite, molti genotipi potenzialmente interessanti quando allevati in coltura pura. Il suo impiego è ora molto limitato, modificandolo in funzione di una riduzione della competizione tra le prime generazioni segreganti nelle prime fasi della selezione. Il metodo di selezione basato sul reincrocio risulta particolarmente utile nel caso si identifichi un carattere ben specifico da trasferire, come per esempio un gene di resistenza, da trasferire in una varietà migliorata, che viene ripetutamente impiegata come genitore ricorrente. L’impiego del reincrocio, associato all’analisi molecolare utilizzando marcatori di selezioni per il particolare tratto, può risultare particolarmente vantaggioso per geni importanti quali per esempio geni di resistenza a Pyricularia. Il metodo pedigree è stato in generale il più largamente impiegato con successo nel miglioramento genetico del riso, sebbene presenti anch’esso alcuni svantaggi. Infatti questo metodo richiede un forte impegno di tempo, in quanto le linee di selezione devono essere valutate in campo singolarmente. Alle osservazioni fenomorfologiche devono essere inoltre associati particolari test di qualità al granello, test di resistenza alle principali malattie e valutazione di altri caratteri. Per questi motivi si comprende come tale metodo, soprattutto nelle zone temperate, venga in realtà attuato con parecchie modifiche per semplificare la valutazione. Infine, una specifica menzione si deve all’impiego della maschiosterilità e alla selezione ricorrente nelle popolazioni. Nel riso, pianta strettamente autogama, il ritrovamento di fonti di maschio-sterilità genetica e genetico-citoplasmatica ha consentito l’applicazione di una schema di incrocio e selezione ricorrente con sfruttamento della ricombinazione genetica e dell’eterosi. Lo schema operativo prevede l’incrocio naturale tra un genotipo maschio-sterile – che possiede geni inducenti la maschio-sterilità – e genotipi donatori di caratteri favorevoli. In F2 si ottiene una popolazione in cui, per effetto della fecondazione incrociata spontanea, viene forzata la ricombinazione tra fattori genetici di varia origine. È quindi possibile selezionare successivamente, per più cicli ricorrenti, piante che riuniscano le caratteristiche favorevoli conferite dai donatori. Il ricorso alla selezione ricorrente risulta particolarmente indicato qualora le varietà richieste debbano possedere una serie di caratteristiche che difficilmente possono essere riunite in un solo individuo tramite metodi di selezione tradizionali.

Ibridi
Il fenomeno dell’eterosi principalmente noto nel mais è presente anche in altri cereali, riso compreso. Circa un terzo della popolazione mondiale basa il suo sostentamento sul riso: per questa ragione, una produzione che assicuri cibo ed energia è di primaria importanza per la sopravvivenza di molti Paesi in via di sviluppo. Il modo forse più eclatante per aumentare la resa produttiva deriva dall’impiego degli ibridi, per ottenere i quali si incrociano due genotipi parentali molto distanti geneticamente. Gli ibridi F1 derivati da incrocio tra due linee geneticamente diverse esprimono eterosi, o vigore ibrido, per caratteristiche agronomiche la maggior parte delle quali sono componenti principali della produzione: la lunghezza della pannocchia, il numero di pannocchie per pianta, il numero di granelli per pannocchia, il peso dei semi, la lunghezza del ciclo vegetativo, lo sviluppo dell’apparato radicale ecc. A causa dell’eterosi, le varietà ibride producono in media dal 10 al 40% in più delle migliori varietà convenzionali. In generale, le combinazioni F1 tra genotipi appartenenti alla ssp. indica presentano valori di eterosi superiori a quelli espressi tra genotipi japonica. Il riso ibrido è derivato principalmente da incroci tra varietà indica differenti, e, in misura molto inferiore, tra varietà japonica. Questo fatto è probabilmente da ricollegarsi alla maggiore variabilità genetica presente nel germoplasma indica rispetto al japonica, o anche alla maggiore pressione selettiva subita da quest’ultimo, che ha cumulato più fattori positivi in un minor numero di genotipi. Ovviamente, per molto tempo si è tentato di creare varietà ibride tra japonica e indica, ma la strada non è risultata percorribile in quanto l’incrocio è caratterizzato da elevata sterilità e, di conseguenza, da scarsissima produzione. Negli anni ’70, la Cina per prima introdusse varietà ibride di riso, con l’opera pionieristica del Centro Nazionale Cinese di Ricerca per il Riso Ibrido e lo Sviluppo, di Hunan. Da allora, la coltivazione del riso ibrido è cresciuta costantemente, e oggi impegna più di 30 milioni di ettari, che rappresentano circa la metà dalla superficie totale coltivata a riso. Il seme ibrido di riso viene prodotto usando un sistema a tre linee: una linea maschio sterile (A), una linea di mantenimento (B) e una linea ristoratrice (R). La linea A viene utilizzata come portaseme per incrocio con la linea R, per la produzione del seme F1. La linea A è moltiplicata per impollinazione con la linea B di mantenimento, incrocio che produce nuovamente seme maschio sterile. L’aumento di resa nella produzione è tale da giustificare ampiamente in Cina l’impiego di questo sistema abbastanza complesso per la produzione di seme ibrido. Con l’intervento dell’IRRI (Istituto di Ricerca Internazionale sul Riso) di Manila, Filippine, le varietà di riso ibrido sono state recentemente introdotte in altri Paesi nella fascia tropicale: India, Bangladesh, Brasile, Vietnam e Thailandia. La superficie coltivata con le varietà ibride sta gradualmente aumentando, sostituendo le varietà tradizionali a resa significativamente inferiore. Recentemente, in Cina è stato sviluppato un sistema completamente innovativo per la costituzione degli ibridi, che ha portato allo sviluppo di un nuovo materiale genetico indicato con il termine di Super-Ibrido. Tale varietà è originata dall’incrocio tra sottospecie indica, japonica e javanica, così da superare la barriera della sterilità. Al posto del sistema tradizionale delle tre linee A, B e R, il riso Super-Ibrido è derivato dall’incrocio tra due linee: una linea maschio-sterile sensibile al fotoperiodo, e una linea normale che funge da parentale maschile. La linea sensibile al fotoperiodo maschio-sterile mostra il 100% di sterilità in condizioni di giorno corto e bassa temperatura. Il seme ibrido viene prodotto in primavera crescendo tale linea maschio-sterile, insieme al parentale impollinatore. Il seme ibrido è raccolto dalle piante portaseme e utilizzato per le semine. Nella maggior parte della Cina, il riso è trapiantato in tarda primavera o inizio estate così che, al momento della fioritura, si hanno condizioni di giorno lungo e di temperatura permissiva e le piante diventano fertili. Come atteso, il riso SuperIbrido ha una resa più elevata, a causa dell’aumentato vigore ibrido. All’Istituto Nazionale di Ricerca sul Riso di Hang-zhou in Cina, il riso Super-Ibrido produce 120-130 q/ha, circa 1,5-2 q/ha in più a confronto con i migliori ibridi tradizionali. Caratteristica importante del Super-Ibrido è il portamento eretto delle foglie, carattere già identificato nel mais, che rappresenta l’ideotipo di una pianta adatta a trarre il maggior vantaggio dall’irraggiamento solare e dagli scambi gassosi con l’atmosfera. Con tali caratteristiche la pianta acquista un apparato fotosintetico più efficiente e pertanto risulta più produttiva. Il riso Super-Ibrido è un perfetto esempio di innovazione genetica con metodologie tradizionali e deriva da un lavoro di miglioramento genetico durato circa 10 anni.

Introgressione di geni utili da specie selvatiche
L’ampia variabilità genetica presente nel genere Oryza offre una fonte di geni di resistenza di inestimabile valore, la maggioranza dei quali però non può essere di diretto impiego nei programmi di miglioramento genetico in quanto le specie di Oryza portatrici dei geni di interesse non sono sessualmente compatibili con O. sativa. In sostanza, solo le Oryza caratterizzate dall’avere il genoma AA possono essere incrociate tra loro e permettere l’introgressione di geni alieni mediante metodologia convenzionale. Pertanto la O. sativa può essere facilmente incrociata con O. nivara, O. longistaminata e O. perennis, per l’introgressione di geni di resistenza specifici, recuperando poi le caratteristiche di O. sativa con ripetuti reincroci sul parentale O. sativa. Esempi che afferiscono a questi processi sono importanti pietre miliari nella storia del miglioramento genetico del riso. Il primo esempio di introgressione di un gene di resistenza è stato, negli anni ’70, il trasferimento della resistenza al grassy stunt virus (RSGV) da O. nivara a O. sativa mediante incrocio della specie selvatica con le cultivar ssp. indica IR8, IR20, IR24. I successivi reincroci e selezione delle linee resistenti hanno portato al rilascio delle varietà migliorate IR28, IR29 e IR30, seguite più tardi da altre varietà come IR32, IR34 e IR36. Da quel momento in poi il gene di resistenza è stato sempre incorporato nelle varietà costituite dall’IRRI di Manila. In analogia, un altro gene di resistenza, presente in O. longistaminata, è stato incorporato in O. sativa, la resistenza al brusone batterico (bacterial blight, BB), causato dal batterio Xanthomonas oryzae, che causa vere e proprie epidemie nel Sud-Est asiatico. Mediante incrocio, selezione e successivo reincrocio sul parentale O. sativa cv IR24, il gene di resistenza, Xa-21, è stato incorporato in varie cultivar; il gene conferisce resistenza a un ampio spettro di patotipi di BB presenti nelle Filippine. Esistono in letteratura molti altri esempi di introgressione di geni alieni in O. sativa anche dalle specie selvatiche caratterizzate da altri corredi genetici (BB, CCDD, EE, FF e GG), ma nella maggioranza dei casi le introgressioni hanno avuto problemi nell’essere mantenute in varietà coltivate.

Tecnica dei diplo-aploidi
Un contributo importante nel miglioramento genetico dei cereali è derivato dallo sviluppo di individui diplo-aploidi a partire da coltura di antere. Attraverso tale tecnica si possono infatti ottenere piante perfettamente omozigoti per rigenerazione diretta dalle microspore (gameti maschili), accelerando il processo di rilascio di nuove varietà. L’ottenimento di tali materiali può avvenire sia attraverso l’impiego di metodi convenzionali, come per esempio nell’orzo attraverso lo sfruttamento del gene hap, sia in vitro mediante coltura di antere o ovari immaturi. Fin dall’inizio dell’applicazione delle moderne tecniche di miglioramento genetico, numerosi sforzi sono stati condotti per accelerare nel tempo la produzione di linee con un elevato grado di omozigosi. Nel riso, così come per altri cereali autogami, occorrono normalmente 5-6 generazioni di autofecondazione dopo l’incrocio, per ottenere un sufficiente grado di omozigosi. Con la coltura di antere espiantate partendo da ibridi F1 è possibile in 1-2 generazioni ottenere linee completamente omozigoti per tutti i caratteri. Dopo i primi ritrovamenti accidentali descritti da Guha e Maheshwari nel 1964, e i primi individui aploidi ottenuti nel riso da Niizeki e Oono nel 1968, nel corso degli anni si è assistito a un impressionante sviluppo di tale tecnica nei laboratori di tutto il mondo. L’applicabilità e lo sfruttamento di tale metodologia nei programmi di miglioramento genetico di una specie risulta funzione della risposta che questa è in grado di dare una volta posta nelle condizioni di coltura in vitro. Tra le diverse specie cerealicole, il riso risulta quella più rispondente, e questo fatto ha permesso un impiego estensivo della tecnica. La risposta in vitro è strettamente genotipo-dipendente: in generale la frequenza di rigenerazione risulta più elevata nelle varietà appartenenti alla ssp. japonica rispetto a quelle della ssp. indica. La frequenza di rigenerazione viene inoltre influenzata da diversi aspetti come: la qualità delle piante in cui viene condotto l’espianto, le condizioni colturali di crescita e lo stato fitosanitario. La rigenerazione di individui diplo-aploidi avviene attraverso un processo spontaneo di diploidizzazione del corredo genetico delle microspore che, nel caso di individui F1, presentano tutta la variabilità genetica della ricombinazione; non tutti i rigenerati da vitro sono diploidi e, in tal caso, si presentano sterili o albini. Questo aspetto peculiare è funzione della specie e del genotipo: tra i cereali, l’orzo presenta la percentuale più elevata di raddoppiamento spontaneo, pari all’87%, seguito dal riso con un valore superiore al 72%, dal grano con il 50% e infine dal mais con solo il 6,3%. La tecnica, di particolare efficacia, è correntemente impiegata nei programmi di miglioramento genetico dell’IRRI (Filippine). In Australia si è ricorso alla coltura di antere per ottenere genotipi DH di riso in grado di esprimere tolleranza alle basse temperature, uno dei principali problemi che condizionano la risicoltura di questo Paese. La coltura in vitro ha permesso di accelerare il rilascio di tali genotipi partendo da antere espiantate da individui F1 ottenuti incrociando varietà di riso australiane sensibili al freddo come Doongara e Amaroo con genotipi di riso appartenenti alla specie Oryza rufipogon introdotti dalla regione dello Yunnan in Cina e caratterizzati dal possedere elevata tolleranza alle basse temperature durante la fase riproduttiva. L’ottenimento di linee diploaploidi nel riso risulta inoltre utile per lo sviluppo di mapping populations sulle quali applicare studi di tipo molecolare con particolare riferimento ai caratteri di tipo quantitativo. Recentemente, molte ricerche hanno impiegato popolazioni diplo-aploidi per costruire mappe genetiche e localizzare QTL. Per esempio, attraverso la costruzione di una mappa di linkage in una popolazione diplo-aploide è stato possibile localizzare la presenza di due QTLs localizzati sui cromosomi 9 e 11 in grado di regolare il portamento più o meno eretto del culmo del riso. Altri studi simili hanno portato invece all’individuazione di QTLs per la lunghezza dell’ultimo internodo, per l’altezza della pianta, per l’intervallo semina-fioritura e per alcuni caratteri relativi alla produzione. In generale, numerose varietà, la maggior parte delle quali appartenenti alla ssp. japonica, sono state ottenute mediante l’impiego di tale tecnologia in Cina, Corea, Giappone e Stati Uniti.

Miglioramento genetico per caratteri principali

L’ideotipo moderno della pianta di riso è chiaramente dipendente da diversi fattori. Nell’area temperata occidentale le condizioni colturali, la meccanizzazione e le richieste del mercato e dell’industria hanno direzionato il miglioramento genetico verso una tipologia di pianta con caratteristiche fenotipiche ben definite, alcune delle quali sono sempre presenti nelle nuove varietà, indipendentemente dalla tipologia e qualità del granello. Esse sono riconducibili ai seguenti caratteri: produzione e sue componenti, architettura della pianta, durata del ciclo colturale, resistenza alle malattie, tolleranza a stress ambientali, qualità del granello.

Miglioramento genetico per la produzione e sue componenti
Nel riso, come negli altri cereali, il potenziale produttivo può essere definito come la produzione ottenuta da una data varietà quando questa si viene a trovare in condizioni ambientali favorevoli, dove acqua e nutrienti non sono fattori limitanti e malattie, parassiti e stress abiotici risultano efficacemente controllati. Nei cereali la produzione rappresentata dal quantitativo di granella prodotta per unità di superficie risulta scomponibile in una serie di fattori o componenti il cui singolo contributo concorre alla determinazione del valore finale. In generale per il riso vengono identificate come determinanti la produzione le seguenti componenti: il numero di culmi per metro quadrato, il numero di spighette per pannocchia, la percentuale di sterilità della pannocchia e il peso unitario delle cariossidi (peso dei 1000 semi). Accanto a questi caratteri puramente legati alle componenti morfologiche della pianta, esistono altri caratteri di natura prevalentemente fisiologica che esercitano un’influenza più o meno marcata sul risultato produttivo come: la risposta nei confronti della fertilizzazione azotata, la capacità fotosintetica e l’efficienza di traslocazione dei fotosintati dalle zone di produzione (source) verso quelle di accumulo (sink). L’analisi genetica ha permesso di assegnare a tali componenti morfologiche e fisiologiche un controllo di tipo poligenico. Tali caratteri agronomici risultano inoltre caratterizzati dal possedere un basso grado di ereditabilità non sempre di facile valutazione, complicata inoltre da forti influenze dovute all’interazione con l’ambiente e con le diverse pratiche colturali. Tra i caratteri su cui il miglioramento genetico ha agito nel corso degli anni, quello relativo alla taglia della pianta è senza dubbio il primo su cui si sono concentrati gli sforzi e l’attenzione dei breeder. Nel riso, così come per gli altri cereali, l’altezza della pianta risulta dipendente sia dal numero di internodi che compongono il culmo sia dall’intensità del loro allungamento durante la fase di levata. Il numero di internodi poi risulta correlato al numero di foglie, variabile tra 10 e 20 per singolo culmo, dipendente anche dalla durata del ciclo vegetativo. Come ampiamente dimostrato, la taglia alta è fortemente correlata alla suscettibilità ad allettamento. Nei principali Paesi a tradizione risicola, compreso il nostro, il germoplasma di riso su cui si è basata la produzione nei primi decenni del XX secolo era rappresentato in netta prevalenza da varietà a taglia elevata e che andavano spesso incontro a problemi di allettamento con inevitabili perdite produttive. A livello internazionale, la riduzione della taglia delle varietà di riso si concretizzò di fatto nel 1960 con quella che ancora oggi viene ricordata con il termine di green revolution. Lo scenario mondiale di quel periodo era caratterizzato da una popolazione in forte espansione a cui si contrapponeva una contrazione delle aree destinate all’agricoltura con conseguente aumento della domanda di cibo. Tale situazione di crisi portò allo sviluppo di programmi di breeding mirati all’ottenimento di nuove varietà – soprattutto di riso e frumento – dalle maggiori capacità produttive. Il principale risultato fu l’introduzione di nuove varietà con morfologia della pianta definita semi-dwarf, ovvero caratterizzate dal possedere taglia ridotta, portamento eretto delle foglie, buona resistenza alla fertilizzazione azotata e conseguentemente all’allettamento. L’applicazione diffusa di tali varietà, e il conseguente aumento dei livelli di fertilizzazione azotata applicati, ha consentito in pratica il raddoppiamento delle produzioni di riso e grano. Il primo contributo della rivoluzione verde in Asia fu il rilascio nel 1966 da parte dell’IRRI, Filippine, della varietà ssp. indica IR8, la prima varietà di riso con morfologia e sviluppo della pianta di tipo semi-dwarf. L’introduzione di tale varietà, identificata in maniera univoca con il termine di “riso del miracolo”, favorì l’aumento della produzione di riso la quale mantenne, per molti anni, una crescita del 2,4% l’anno. L’IR8 fu sviluppata attraverso incrocio tra il mutante spontaneo di origine cinese Dee-geo-woo-gen (DGWG) omozigote recessivo per il gene semi-dwarf 1 (sd1) e la varietà di origine indonesiana Peta caratterizzata da taglia elevata. Successivamente anche le varietà Taichung Native 1 (TN1), originaria di Taiwan, e Tongil, originaria della Corea, sono state sviluppate mediante incrocio con DGWG e presentano nel genoma l’allele sd1. Analogamente, lo sviluppo di mutanti semi-dwarf e il loro conseguente impiego nei programmi di breeding hanno rivestito un ruolo fondamentale per lo sviluppo della risicoltura in altri Paesi come il Giappone e in California. In questi Paesi, attraverso trattamenti mutageni mediante l’impiego di raggi gamma, è stato possibile ottenere due varietà semi-dwarf nella ssp. japonica: Reimei per il Giappone e Calrose76 per gli USA. L’impiego di queste varietà in modo sistematico nei successivi programmi di breeding ha permesso una sostanziale riduzione della taglia di circa il 25%, lasciando praticamente immutata nelle dimensioni la pannocchia. Nel 1976 – sempre all’IRRI – venne derivata da IR8 la varietà IR36 caratterizzata, oltre che dalla taglia semi-dwarf, da un ciclo di crescita di circa 20 giorni inferiore a quello del suo progenitore. In generale, i diversi mutanti semi-dwarf ritrovati e/o ottenuti sono stati ampiamente caratterizzati sia a livello genetico sia fisiologico e sono stati applicati in maniera sistematica nei programmi di miglioramento genetico del riso. La principale caratteristica legata alla presenza in forma recessiva dell’allele sd1 è un blocco parziale della via metabolica che porta alla biosintesi dell’acido gibberellico (GA), principale ormone responsabile dell’accrescimento. A livello del locus sd1 il gene SD1 è in grado di codificare per un enzima la GA20 ossidasi-2 che catalizza le ultime fasi della via biosintetica delle gibberelline. Pertanto, la ridotta o totale perdita di funzionalità dell’enzima GA20 ossidasi-2 determina una diminuzione nel contenuto in acido gibberellico causando una riduzione nell’altezza della pianta. Il meccanismo di azione dell’allele sd1 risulta differente nelle due sottospecie indica e japonica. Nelle varietà indica (come IR8) l’allele contiene una delezione di 383 paia di basi tra l’esone 1 e l’esone 2, che induce uno spostamento della sequenza generando un nuovo codone di stop. Tale allele viene pertanto considerato come un allele nullo. Nelle varietà della ssp. japonica (Jikkoku, Reimei e Clarose 76) il gene sd1 presenta la sostituzione di un singolo nucleotide, che determina la modificazione di un singolo aminoacido. In generale l’effetto determinato dal gene sd1 nel riso risulta simile a quanto avviene nel grano con il gene Rht (Reduced height), in entrambi i casi si assiste a una riduzione della taglia a cui risulta associato un significativo incremento della produzione. Pur agendo entrambi sulle gibberelline, le basi molecolari per il carattere semi-dwarf risultano differenti nelle due specie. Mentre nel riso si assiste a una perdita di funzionalità dell’enzima GA20 ossidasi-2 che determina la mancata produzione di acido gibberellico, nel grano le varietà che presentano uno o entrambi i geni Rht manifestano un’insensibilità alle gibberelline. In generale, nel riso si assiste alla presenza di numerosi mutanti sia di tipo dwarf sia semi-dwarf, e la maggior parte di queste mutazioni risulta recessiva. Recentemente, sottoponendo la varietà NL8 al trattamento con raggi gamma, è stato possibile ottenere un mutante dwarf di riso il cui gene dwarf D-53 risulta dominante. I mutanti per questo gene, oltre a possedere la taglia ridotta, presentano abbondante accestimento, pannocchie corte e culmi sottili. Sempre nel riso, oltre ai mutanti semi-dwarf, sono stati identificati circa 61 geni dwarf differenti (da d-1 a d-60) responsabili della riduzione nella taglia della pianta. L’introduzione dei marcatori molecolari ha permesso inoltre di individuare la presenza di diversi QTLs per quanto riguarda l’altezza della pianta. Più tardi, verso gli anni ’80, i genetisti e i fisiologi dell’IRRI evidenziarono come tali caratteristiche potevano limitare futuri incrementi del potenziale produttivo. Di fatto le varietà frutto della green revolution presentavano un’elevata produzione di culmi di accestimento nella maggior parte improduttivi oltre che un’elevata presenza di foglie. Questa particolare morfologia determinava una limitazione nella dimensione del sink rappresentato da pannocchie di ridotte dimensioni. Queste considerazioni indussero a mutare nuovamente il concetto di morfologia della pianta in funzione dell’incremento del potenziale produttivo. Nacque in questo modo un nuovo modello di pianta di riso le cui caratteristiche sintetizzate nel concetto di New Plant Type prevedono: una ridotta capacità di accestimento (circa 3-4 culmi per pianta in condizioni di semina diretta), 200-250 granelli per pannocchia, altezza della pianta compresa tra 90 e 100 cm, foglie scure ed erette, apparato radicale vigoroso, ciclo medio-breve (100-130 giorni) ed elevato harvest index. Proprio in relazione a questo ultimo aspetto nei cereali la produzione risulta funzione del quantitativo di biomassa prodotta dalla pianta e dell’harvest index (rapporto tra la produzione di granella e la produzione di paglia). Incrementi produttivi possone essere ottenuti agendo sulla biomassa totale viceversa sull’indice di raccolta oppure su entrambi. Le moderne varietà di riso a portamento semi-dwarf sono in grado di produrre circa 1819 t/ha di biomassa totale con un harvest index compreso tra 0,45 e 0,50. Per aumentare l’harvest index occorre agire cercando di aumentare le dimensioni del sink attraverso l’aumento del numero di granelli per pannocchia. Recentemente, uno studio condotto mediante l’impiego di marcatori molecolari su una popolazione di 164 linee F11 derivanti dall’incrocio tra le varietà Milyang 23 e Gihobyeo ha permesso di individuare la presenza di 75 QTL per nove caratteri determinanti la produzione. Tra questi: 12 QTL sono stati identificati per il numero di pannocchie per pianta, 10 per il numero di spighette per pannocchia, 11 per il peso dei 1000 semi e 12 per la lunghezza della pannocchia.

Miglioramento genetico per precocità del ciclo
Nel riso, la durata dell’intervallo tra la semina e la fioritura rappresenta uno dei principali caratteri agronomici in grado di influenzare la capacità di adattamento di una varietà nei differenti ambienti di coltivazione. Per tale ragione il controllo del carattere rientra tra i principali obiettivi preposti dal miglioramento genetico di questa coltura. Appurato che l’intervallo tra la fioritura e la maturazione fisiologica si dimostra relativamente costante nelle diverse varietà, l’epoca di fioritura si dimostra determinante nel discriminare tra genotipi precoci e tardivi. In generale l’epoca di fioritura è controllata da fattori genetici e da condizioni ambientali. La sensibilità al fotoperiodo nel riso risulta uno dei caratteri più complessi, in cui spesso gli studi condotti hanno portato a risultati non sempre in accordo tra loro. Il riso è una specie a giorno corto ovvero il passaggio dalla fase vegetativa a quella riproduttiva avviene quando la lunghezza del giorno risulta inferiore al fotoperiodo critico. Esiste un ampio grado di variabilità genetica relativamente a questo carattere, passando da varietà di riso che sono insensibili al fotoperiodo fino ad altre altamente sensibili. La manipolazione della sensibilità nei confronti di questo carattere risulta fondamentale sia nelle aree tropicali sia in quelle temperate di coltivazione al fine di ottimizzare il ciclo colturale in funzione delle caratteristiche ambientali. In generale, meno sensibile risulta una varietà maggiore è il range di variazione del fotoperiodo ottimale. La maggior parte delle varietà normalmente presenta l’optimun del fotoperiodo intorno alle 9,5-11 ore. Ancora, in condizioni di luce naturale le varietà insensibili risultano quelle più precoci mentre quelle più sensibili sono le più tardive. Ai nostri livelli di latitudine (45° parallelo) le varietà migliori per quanto riguarda l’adattamento ambientale devono avere caratteristiche di insensibilità o debole sensibilità al fotoperiodo: le varietà che risultano altamente sensibili al fotoperiodo non giungono a fioritura se poste in situazioni di giorno lungo. A livello genetico, diversi geni risultano coinvolti nella risposta al fotoperiodo, e tra questi sembra che il principale sia il gene Se1 (photoperiod sensitivity 1) che si trova localizzato sul cromosoma 6 del riso. Analogamente ad altri caratteri, l’epoca di fioritura può essere considerata un carattere complesso in ragione della variabilità continua manifestata nella progenie di un determinato incrocio. Per tale ragione il controllo del carattere può essere spiegato solamente da un controllo di tipo poligenico. Lo sviluppo della genetica molecolare degli anni recenti ha permesso – attraverso le analisi dei QTLs – di chiarire il numero e la natura dei geni che sono coinvolti nel controllo della fioritura nel riso. In un lavoro pubblicato nel 2001, Yano et al. riportano l’identificazione, nella progenie ottenuta dall’incrocio tra le varietà Nipponbare (japonica) e Kassalath (indica), di 14 QTL coinvolti nel controllo dell’epoca di fioritura. Di questi Hd1 risulta il principale QTL in grado di determinare l’epoca di fioritura. Inoltre studi approfonditi hanno evidenziato che il gene che regola la risposta al fotoperiodo (Se1) è allelico all’Hd1. Studi genetici hanno dimostrato come Hd1 può funzionare in modo differente nelle condizioni di giorno corto o lungo, promuovendo la fioritura nelle condizioni di giorno corto e viceversa inibendola nel giorno lungo.

Miglioramento genetico per resistenza alle malattie e altri agenti biotici
I danni causati da malattie, insetti e virus rappresentano una seria causa di mancata produttività in varie aree del mondo, particolarmente nelle zone a clima caldo-umido tropicali e sub-tropicali. In queste zone, la riduzione della variabilità genetica dovuta alla graduale sostituzione delle varietà locali con poche varietà coltivate, insieme alle agrotecniche e all’adozione della monocoltura, hanno causato una aumentata vulnerabilità della coltura nei confronti delle avversità biotiche. Nelle zone a clima temperato, in cui la coltura viene praticata con un solo ciclo all’anno, l’incidenza dei parassiti è molto inferiore e raramente si hanno epidemie. L’identificazione di fonti genetiche di resistenza al brusone e la costituzione di varietà nuove più competitive introgredendo in esse le fonti di resistenza alla malattia, sono obiettivi primari in ogni programma di miglioramento genetico della specie in ogni parte del mondo. Il controllo della malattia mediante la coltura di varietà caratterizzate da fonti di resistenza è ancora oggi il metodo più efficace per combattere il brusone che, se lasciato diffondere, può assumere proporzioni epidemiche. La dinamica e contemporanea evoluzione del patogeno con il suo ospite complica ulteriormente il compito del miglioramento genetico. Lo studio della variabilità genetica della popolazione di Pyricularia nei vari areali ha permesso di individuare i patotipi principali – raggruppati in un limitato numero di lineages – e i corrispondenti geni di resistenza a essi. Attualmente sono noti più di 40 geni di resistenza a Pyricularia (geni Pi), localizzati su tutti i 12 cromosomi del genoma del riso; di essi, solo alcuni sono stati clonati e caratterizzati. L’identificazione di genotipi di riso caratterizzati da uno specifico gene di resistenza e la costituzione di NILs (Near Isogenic Lines), linee contenenti il gene di resistenza in background genetici differenti, hanno permesso lo studio della patogenicità specifica dei singoli lineages. All’IRRI, nelle Filippine, sono state costituite varie NILs a partire da incroci derivati da genotipi sia indica sia japonica così che, tramite esse, è stato possibile valutare ogni nuovo singolo gene di resistenza, i nuovi patotipi, effettuare clonaggio di posizione dei geni Pi, e iniziare programmi di miglioramento genetico per il pyramiding di geni Pi diversi entro un singolo genotipo. Molte varietà rilasciate dall’IRRI (varie IR) portano molteplici geni di resistenza a Pyricularia; l’opera di breeding americano ha permesso il rilascio recente di nuove varietà caratterizzate da potenti geni Pi ad ampio spettro (come per esempio il gene Pi-ta). Lo sviluppo attuale dei programmi di miglioramento genetico per l’introgressione e il pyramiding dei geni Pi nelle nuove varietà, si avvale dell’aiuto di marcatori molecolari di vario tipo atti a seguire l’introgressione e la presenza del/i geni Pi nelle nuove costituzioni. Forse il miglioramento genetico assistito con i marcatori molecolari per resistenza al brusone è uno degli esempi migliori e più efficaci di breeding assistito attualmente in sviluppo. Programmi di questo tipo sviluppati all’IRRI hanno permesso l’introgressione di 3 geni, Pi-1, Pi-2 e Pi-4 in 10 cultivar di primaria importanza, tra le quali IR36, IR50, IR64 e IR72. Molti altri Paesi stanno percorrendo questa strada per la costituzione di nuove varietà, tra i quali USA, Colombia, India, Thailandia, Vietnam. Tra i vari altri agenti biotici che attaccano la coltura del riso, come detto, ne esiste una grande varietà soprattutto in ambiente tropicale. I programmi di miglioramento genetico sono pertanto guidati dalle necessità locali, e il reperimento di genotipi con fonti di resistenza al particolare agente biotico è l’azione primaria che viene intrapresa in ogni caso, seguita dall’identificazione dei geni di resistenza specifici. Così il brusone batterico, causato da Xanthomonas oryzae, è stato studiato estensivamente all’IRRI. La resistenza agli isolati patogenici del batterio è controllata da vari geni diversi dei quali alcuni dominanti (per es. Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa6 e Xa10) e altri recessivi (per es. xa5, xa8 e xa9). Il gene Xa21 è stato inoltre oggetto di studio per l’ottenimento di cultivar migliorate tramite introgressione non convenzionale del gene, con trasferimento genico operato tramite Agrobacterium tumefaciens in O. sativa. Sono stati identificati almeno 9 major genes di resistenza a BB, e 1 QTL, posizionati in un cluster in un tratto di 30cM sul cromosoma 11 di O. sativa. Il gene Xa21 è stato identificato tramite clonaggio di posizione, e il suo prodotto genico identificato in una proteina chinasica di tipo recettoriale, ereditato come singolo tratto mendeliano dominante. Piante transgeniche ottenute introgredendo Xa21 mediante trasformazione genica sono risultate altamente resistenti a 29 patotipi di Xanthomonas oryzae di varia provenienza. Per quanto riguarda gli insetti, sebbene nell’areale mediterraneo essi siano presenti (Chilo, Sesamia) non rappresentano una primaria fonte di danno, come invece accade per il riso delle aree caldo-umide. Negli anni recenti, con l’apertura delle frontiere, nuove specie sono entrate nel nostro habitat, come per esempio il coleottero Lyssorhoptrus oryzophilus, introdotto dagli USA, che si sta diffondendo anche nei nostri ambienti. La resistenza agli insetti è di fatto uno dei pochi esempi di un vero breakthrough nello sviluppo delle biotecnologie vegetali: prova ne è che il mais bt (resistente alle infestazioni di Ostrinia nubilalis) è uno degli esempi più importanti tra le PGM coltivate nel mondo. Nel riso, la resistenza agli insetti è stata considerata prioritaria nella costituzione di varietà transgeniche recanti questo tratto e la Cina ha introdotto la coltura del riso bt dal 2005. Altre resistenze ad agenti biotici non hanno avuto il medesimo successo, sebbene ne siano disponibili svariate.

Miglioramento genetico per tolleranza agli stress abiotici
Come già introdotto, la coltivazione del riso è presente in numerosi Paesi, interessando situazioni ambientali e pedo-climatiche differenziate. Anche in funzione della metodologia di coltivazione si passa da situazioni estreme quali per esempio quelle dei risi upland o di montagna, capaci di crescere con il solo approvvigionamento di acqua derivato dalla pioggia, per arrivare ai risi flottanti che crescono viceversa nelle paludi di alcune regioni tropicali di Asia, Africa e America Latina, dove l’acqua di sommersione della coltura può raggiungere altezze variabili comprese da 1 fino a 7 metri. La notevole differenziazione caratterizzante le condizioni di coltivazione nonché le variazioni ambientali spesso repentine e improvvise che si verificano durante il ciclo colturale espongono la pianta a una serie di stress di varia natura limitandone notevolmente la capacità produttiva. Tra le numerose tipologie di stress di natura abiotica che interessano il riso si ricordano quelli che nel corso degli anni sono stati maggiormente oggetto di miglioramento genetico, ovvero: la tolleranza alla carenza idrica, l’eccesso di sale nel suolo e le basse temperature.

Tolleranza alla carenza idrica e all’accumulo di sale nel suolo
Recentemente, anche nell’areale di coltivazione temperato, dove la disponibilità di acqua superficiale è quanto mai determinante per la crescita di tale coltura, a seguito dei mutamenti climatici che stanno caratterizzando questi ultimi anni, si sono verificate situazioni di deficit idrico con pesanti ripercussioni sulla produzione e qualità della coltura. I programmi di miglioramento genetico in questo settore hanno recentemente portato in Cina (URRC-CAU Upland Rice Research Centre, Università di Pechino) alla costituzione di varietà molto competitive come Qinai e alcune varietà Handao (japonica) e Nongxuan 2 (indica). In molti Paesi viene effettuato un grande sforzo nella costituzione di varietà competitive, tolleranti il secco, come in Egitto (derivativi delle varietà della serie Giza e Sakha). Tale metodologia operativa risulta però relativamente lenta a causa di: bassa ereditabilità che contraddistingue il carattere produzione in condizioni di stress, difficoltà di valutazione per la variabilità ambientale espressa dal campo, necessità di ripetere la selezione in più anni e ambienti differenti. Un’alternativa per lo sviluppo di queste varietà consiste nel ricercare e migliorare quelli che vengono identificati come caratteri secondari in grado di conferire tolleranza alla carenza idrica, andando poi ad agire su di essi con la selezione e il miglioramento genetico. Nel riso sono stati identificati diversi caratteri in grado di fornire un contributo alla tolleranza nei confronti della siccità. A tale proposito, molti studi riguardano lo sviluppo dell’apparato radicale. In genere, nelle varietà di riso upland, la presenza di un apparato radicale profondo, denso e caratterizzato da una buona capacità di penetrazione nel suolo risulta prerogativa fondamentale per garantire una buona performance anche in presenza di ridotta disponibilità idrica. Ancora, numerosi meccanismi di resistenza risultano associati alla porzione epigea della pianta (culmi e foglie). Variazioni genetiche significative nel germoplasma di riso sono state osservate per caratteri quali: arrotolamento fogliare (leaf rolling), chiusura degli stomi, presenza di cere epicuticolari, capacità di regolazione osmotica. Proprio quest’ultimo aspetto risulta tra i principali in grado di conferire resistenza alla carenza idrica nel riso. La capacità di accumulo dei soluti nelle cellule, durante la fase di stress idrico, consente di mantenere elevato il turgore dei tessuti e il potenziale dell’acqua nelle foglie, limitando il leaf rolling, la senescenza delle foglie e la morte dei tessuti. Ciò nonostante la selezione fenotipica per questi caratteri risulta estremamente difficile e richiede un notevole dispendio di lavoro e tempo. Numerosi QTLs associati specificatamente alle caratteristiche legate all’apparato radicale e alla capacità di osmoregolazione sono stati identificati e documentati in diversi lavori. Lo studio dei caratteri principali quali la produzione e le sue componenti misurate in condizioni di stress, è iniziato solamente negli ultimi anni, e la ricerca internazionale ha promosso vari studi coordinati in uno sforzo comune per affrontare il problema. Attraverso il coordinamento tra ricercatori appartenenti all’IRRI e il Rice Research Institute in Thailandia, è stato possibile realizzare un mapping population di 219 linee diplo-aploidi ottenute dall’incrocio tra i genotipi CT9993-5-10-1-M e IR62266-42-6-2, rendendola disponibile ai diversi ricercatori operanti in India, Filippine, Thailandia e Stati Uniti con l’obiettivo di valutarne la risposta allo stress in situazioni pedoclimatiche differenti, e comparare i risultati attraverso l’analisi dei QTLs. Gli studi condotti in India hanno permesso di individuare le relazioni esistenti tra specifici QTLs per i caratteri della radice e la produzione, e di collocarli sul cromosoma 4 del riso. Sono stati inoltre identificati sul cromosoma 1 QTLs associati al mantenimento dello stato idrico della pianta, sul cromosoma 3 QTLs relativi alla produzione di biomassa e infine sul cromosoma 9 QTLs associati alla risposta della fioritura. Nei lavori condotti in Thailandia sono stati confermati i QTLs identificati in precedenza e inoltre ne sono stati individuati altri sul cromosoma 4 per la produzione di biomassa e granella in condizioni di stress. Attraverso lo sviluppo dell’International Rice Molecular Breeding Program nel 1998 a opera dell’IRRI, è iniziata un’attività mirata all’introgressione di questi QTLs per resistenza alla carenza idrica nel background genetico delle principali varietà commerciali di riso. L’obiettivo principale risulta pertanto lo sfruttamento della MAS per concentrare questi principali QTLs all’interno del genoma di varietà di riso dall’alto valore produttivo e commerciale, azione nota col nome di gene pyramiding. In Europa, la tematica ha avuto un ampio approfondimento nel progetto CEDROME (INCO-CT2005-015468) nell’ambito del VI Programma Quadro Eu, che vede coinvolti dieci partner internazionali, appartenenti all’area mediterranea e alla Cina. L’eccesso di sale nel suolo risulta un’altra fonte di stress ambientale in grado di influenzare negativamente numerosi aspetti della fisiologia della pianta del riso. L’eccesso di sali nel suolo può derivare da molti fattori tra i quali elevate temperature e conseguente concentrazione nelle acque di irrigazione, oppure colture in zone costiere dove le infiltrazioni di acqua di mare causano aumento della salinità delle acque e del suolo. Si è assistito spesso a un’associazione della resistenza con la taglia alta della pianta, individuando le varietà con il migliore valore di harvest index come quelle più sensibili all’eccesso di sale. In generale, lo sviluppo vigoroso in una varietà risulta una componente importante nella tolleranza a questo stress. A questo aspetto occorre aggiungere la capacità di limitare l’assorbimento di sodio da parte delle radici, la capacità di traslocarlo nelle diverse parti della pianta, e infine la capacità di tollerare elevate concentrazioni di sale nelle foglie. Uno dei principali approcci, utilizzati nel miglioramento genetico per il carattere di tolleranza, ha compreso incrocio e selezione eseguita in funzione di criteri fisiologici, e la seguente combinazione di questi caratteri favorevoli in un’unica varietà. Ciò ha permesso il rilascio da parte dell’IRRI nel 1997 di due varietà particolarmente tolleranti.

Tolleranza al freddo. Come per altri caratteri, anche nel riso si riscontra un elevato grado di diversità genetica per la risposta al freddo: la ssp. indica tipica delle zone tropicali è molto più sensibile al freddo della ssp. japonica, e quest’ultima differisce nella risposta tra i due gruppi di japonica tropicale e temperata. Il miglioramento genetico si avvale di osservazione visiva per il carattere di early vigor delle plantule nelle prime fasi dello sviluppo a basse temperature, ma questo tipo di screening è difficilmente valutabile a causa delle condizioni sperimentali variabili. Studi genetici attestano che il carattere di tolleranza al freddo è complesso e sicuramente controllata da più geni. È invece accertato che il danno da freddo alla foglia è sotto il controllo di un major gene Cts2(t) e l’espressione della clorosi della foglia è controllata dal gene Cts1(t). Analisi QTL per risposta al freddo allo stadio di plantula hanno permesso di identificare 5 QTLs associati al carattere, uno per ciascuno dei cromosomi 1, 9 e 11, e due sul cromosoma 3; ulteriori studi hanno identificato altri QTLs sui cromosomi 5 e 12. È noto inoltre che i QTLs che regolano la risposta al freddo a livello di plantula sono diversi dai QTLs responsabili della risposta al freddo a livello di iniziazione della pannocchia.

Miglioramento genetico per la qualità del granello
Una speciale digressione merita il miglioramento genetico del riso per la sua qualità, soprattutto nel considerare le produzioni di riso dei Paesi occidentali, dove la qualità riveste una particolare importanza, per soddisfare le esigenze dei consumatori e dell’industria. Il concetto di qualità per il riso sembra essere, allo stato attuale delle richieste di mercato, quanto mai complesso e misurato con parametri e caratteristiche estremamente differenti tra di loro. L’apertura globale dei mercati induce a caratterizzare il prodotto anche in funzione di nicchie di mercato che consentano di far apprezzare un prodotto di elevato valore, che lo renda preferenziale e competitivo rispetto ad altre produzioni. Tutti questi dati, disponibili oggi mediante tecniche analitiche a elevata definizione, contribuiscono a direzionare il miglioramento genetico verso la costituzione di nuove varietà oltre a meglio caratterizzare produzioni locali di varietà di particolare pregio in funzione per es. di marchi di qualità DOP e IGP. Queste e altre varietà tradizionali sono note per nome al consumatore italiano, e sono conosciute nel mondo come sinonimo di una qualità particolare, associata alla preparazione culinaria specifica. La metodologia di utilizzazione del riso ha senza dubbio influito sulla ricerca di specifici standard varietali, in particolar modo per quanto riguarda la tipologia e le caratteristiche qualitative del granello. L’estrema variabilità caratterizzante la nostra risicoltura si identifica nel panorama varietale nazionale. Attualmente risultano iscritti al Registro Nazionale delle varietà ben 143 genotipi di riso diversificati per caratteristiche morfologiche (taglia, portamento, tipo di pannocchia, ciclo di crescita), agronomiche (adattabilità a differenti condizioni pedoclimatiche) e qualitative (biometrie del granello, resa alla lavorazione, contenuto in amilosio, comportamento nei confronti della cottura). Questa elevata diversificazione varietale non viene mantenuta quando si sposta l’analisi a livello di distribuzione della superficie di coltivazione. Il panorama risicolo evidenzia infatti una realtà costituita da circa 15 varietà che da sole coprono circa il 90% dell’intera superficie nazionale, mentre le restanti varietà incidono per valori di superficie non significativi. Della produzione risicola nazionale disponibile, solitamente il 40% è destinato al mercato interno italiano, ed è rappresentato dalle varietà il cui prodotto è utilizzato per la preparazione di risotti, minestre e dei piatti della tradizione italiana. Il 50% è destinato verso i Paesi comunitari comprendendo prevalentemente le tipologie tondo e i tipi a profilo indica (lungo B); il rimanente 10% risulta destinato all’esportazione verso i Paesi extra CE. Fino a metà degli anni ’80, il panorama varietale italiano risultava caratterizzato da varietà tipicamente japonica accomunate dal possedere un granello tondeggiante o allungato a volte con endosperma più o meno perlato e con un contenuto in amilosio medio-basso. A partire dalla seconda metà degli anni ’80 si è registrato un aumento del consumo comunitario di risi a granello lungo e affusolato. Questo ha spinto la ricerca varietale verso l’ottenimento di genotipi con granello a profilo indica, identificati nella classificazione europea come Lungo B. Va precisato che il termine indica utilizzato per queste varietà è di puro riferimento per la tipica forma del granello, mentre il genoma resta prevalentemente japonica. Tutto questo ha creato una prima diversificazione del panorama varietale italiano aprendo nuovi spazi di mercato e nuove opportunità di commercializzazione al di fuori dei confini nazionali. L’industria poi, diversificando processi e prodotti derivati, ha ulteriormente direzionato il miglioramento varietale verso l’ottenimento di genotipi dotati di granello con caratteristiche fisico-chimiche ideali per la trasformazione (endosperma cristallino, alto contenuto in amilosio, assenza di difetti). Attualmente il gruppo dei risi destinanti al parboiled rappresenta una fetta importante sia in termini di varietà sia in termini di superficie di diffusione, includendo genotipi a granello Lungo A e Lungo B. Altri settori sono occupati, sebbene in minor misura, dai risi aromatici (o fragrant) e dai risi pigmentati (rossi e neri). Oggi il miglioramento genetico per la qualità del granello si orienta verso l’impiego delle più recenti tecniche molecolari per assistere la selezione mediante marcatori funzionali designati a seguire le variazioni molecolari a livello dei geni responsabili dei tratti qualitativi. Primo fra tutti il gene waxy che regola il contenuto di amido nelle sue componenti amilosio e amilopectina, il gene frg (fragrant) la cui presenza in condizione di omozigosi recessiva determina l’aromaticità del genotipo, e geni per la pigmentazione (Rc e Rd), dove ancora l’aspetto fenotipico – riconducibile al colore del pericarpo – è facilmente tracciabile visivamente. Per la selezione assistita si dispone oggi di una serie cospicua di marcatori molecolari, per questi caratteri, di vario tipo (microsatelliti, SNPs ecc.) che permettono un rapido avanzamento delle selezioni nella costituzione varietale.

Biotecnologie come strumento per l’innovazione varietale

Il settore di ricerca – successivamente divenuto operativo – delle biotecnologie vegetali nacque attorno al 1960, quindi data oggi circa mezzo secolo. L’evoluzione di questo settore fa capo inizialmente alla nascita della biologia cellulare e delle colture in vitro. Questa tecnica permette la rigenerazione di piante complete fertili a partire da colture in vitro di cellule e tessuti vegetali. Essa si è sviluppata dapprima con l’obiettivo prioritario di studiare le possibilità di rigenerare in vitro qualsiasi specie vegetale, soprattutto specie di interesse agrario, in funzione di esigenze ben precise nei programmi di miglioramento genetico (per es. colture di antere per l’ottenimento di piante diplo-aploidi). È interessante notare che il riso è stato una delle prime specie a essere effettivo in questo settore – e il primo come specie cereale – permettendo la costituzione di diverse varietà coltivate derivate con questa tecnica. La scoperta della variabilità genetica indotta dal passaggio in vitro – codificata negli anni ’80 con il termine di “variazione somaclonale” – ha portato le colture in vitro verso il settore biotecnologico con l’intento di sfruttare questa variabilità, spontanea o indotta, ai fini della realizzazione di cultivar migliorate per caratteristiche precise. Negli stessi anni veniva scoperto il meccanismo mediante il quale un batterio del suolo – Agrobacterium tumefaciens – era in grado di trasferire geni specifici residenti su un tratto di DNA del proprio plasmide Ti, alla cellula vegetale di specie dicotiledoni. L’enorme quantità di dati derivata dagli studi del processo di ingegneria genetica di Agrobacterium portò, in un tempo relativamente breve, alla realizzazione di tecniche di trasformazione di specie vegetali mediate da Agrobacterium e/o dirette (sistema biolistico). Tra i cereali, specie monocotiledoni quindi non direttamente attaccabili da Agrobacterium, fu ancora il riso la prima a essere trasformata tramite questo sistema, dopo la scoperta che l’addizione di un elicitore – il composto fenolico acetosiringone – era in grado di promuovere l’introduzione di DNA mediata da Agrobacterium anche nelle specie monocotiledoni. Il riso, protagonista dell’evoluzione delle tecniche di trasferimento genico con geni di vari organismi e dalle più svariate funzioni, è divenuto emblema della pianta Ogm rafforzata dal punto di vista nutritivo con la realizzazione del Golden Rice, un genotipo ottenuto introgredendo nel genoma di una varietà coltivata, geni per la sintesi di precursori della Vitamina A (www.biotech-info.net/GM_talev). Dagli anni ’90 in poi il termine biotecnologie vegetali divenne sinonimo di piante geneticamente modificate (piante Ogm), e dette origine al dibattito – ancora attuale – sulla possibilità o meno di considerare le piante Ogm cultivar analoghe alla controparte tradizionale. Dal 2005 la Cina ha introdotto la coltivazione estensiva del riso bt, in grado di difendersi dagli attacchi di insetti parassiti; all’IRRI, estensivi programmi di miglioramento genetico tendono alla incorporazione di vari tratti entro una medesima cultivar mediante tecniche diverse, utilizzando la transgenesi per l’introduzione di un carattere definito di resistenza entro una varietà ottenuta eventualmente da incrocio interspecifico, e sfruttando l’eterosi nella produzione di seme ibrido. Le stime dell’incremento produttivo ottenuto in questo modo prevedono una crescita del prodotto fino al 30% rispetto alla produzione attuale. La frontiera del miglioramento genetico non solo del riso, ma delle piante coltivate, sarà probabilmente questa. Ma il settore delle biotecnologie vegetali non include solamente le piante transgeniche. Esso comprende tutte le aree della biologia molecolare che permettono di osservare il genoma della pianta e comprendere i meccanismi essenziali che regolano l’espressione di geni chiave determinanti, come termine ultimo, le caratteristiche élite di un genotipo. Il miglioramento genetico convenzionale è ora affiancato da una gran varietà di metodologie genetico-molecolari, la principale delle quali riguarda l’impiego di marcatori molecolari. Questo ramo della biologia molecolare – sviluppatosi dagli anni ’80 – utilizza sequenze che fungono da “marcatori” per la presenza di particolari tratti fenotipici che sono osservabili quando, mediante analisi del DNA genomico esplorato con le sequenze in questione, essi si rivelano a esse specificatamente associati. Di questi marcatori molecolari, attualmente ne esiste una gran varietà, a partire dai marcatori RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), ai microsatelliti SSR (Simple Sequence Repeats), sino agli SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). L’impiego di questi ha permesso lo sviluppo dei programmi di miglioramento genetico assistito (MAB), il cui contributo è stato sostanziale nella costituzione di varietà moderne e competitive nel riso e in varie specie coltivate. Recenti sviluppi nel settore della genetica strutturale e funzionale su specie di importanza agronomica come mais e riso hanno permesso lo sviluppo di marcatori funzionali (FMs), i quali sono derivati da siti polimorfici di geni responsabili della variabilità genetica di tratti fenotipici. Nelle specie vegetali, i marcatori FM sono impiegati negli studi di miglioramento genetico e in studi sulla biodiversità. Grandi progetti internazionali, dei quali menzioniamo il Rice Microarray Project del Ministero dell’Agricoltura Giapponese, hanno permesso di stabilire una banca dati derivata dall’analisi di espressione con cDNAs che coprono l’intero genoma del riso. Infine, sono proprio i vari mezzi investigativi forniti dalla complementazione delle varie aree delle biotecnologie a fornire i mezzi principali per la progressione del miglioramento genetico moderno delle specie coltivate. Termine ultimo di questo processo è l’analisi del genoma attuato mediante la genetica comparativa.

Il genoma del riso è stato decodificato
Nel 2002, i codici genetici di Oryza sativa, sia indica sia japonica, sono stati pubblicati e resi disponibili alla comunità scientifica. Si è trattato del primo genoma di un cereale coltivato e domesticato dall’uomo a essere completamente decodificato. Il genoma del riso è costituito da 430 milioni di nucleotidi suddivisi in 12 cromosomi. Tale risultato è derivato dall’azione parallela di due iniziative internazionali che si sono focalizzate nel determinare con accuratezza le differenze e similarità tra i due genomi indica e japonica. Le due iniziative sono quelle guidate dall’International Rice Genome Sequencing Project e dal Beijing Genomics Institute. I dati generati da questa attività hanno permesso di comprendere i meccanismi di evoluzione dei genomi all’interno del genere Oryza. La disponibilità dell’intera sequenza del genoma nucleare delle due sottospecie del riso maggiormente coltivate nel mondo ha anche aperto la possibilità di realizzare una serie di approcci sperimentali atti alla definizione della struttura e del funzionamento dei geni, intesi come le unità principali del codice genetico del riso. La sequenza dei 12 cromosomi che costituiscono il genoma del riso è oggi disponibile nel sito web del TIGR con una specifica annotazione delle regioni codificanti e non codificanti del genoma, la loro correlazione con le mappe fisiche e mappe genetiche generate da vari laboratori negli anni scorsi. Tale livello di integrazione ha accelerato l’identificazione e il clonaggio di geni rilevanti per lo sviluppo e l’adattamento del riso a diverse condizioni ambientali. La decodifica del genoma di riso ha permesso la stima precisa del numero di geni – e quindi di proteine – che costituiscono il patrimonio genetico del riso. I numeri di geni identificati nelle due sottospecie di riso sequenziate indica e japonica sono molto simili, e in base al programma di predizione utilizzato variano da 4000 a 56.000. Una comparazione tra i due genomi vegetali maggiormente studiati a oggi, quello di Arabidopsis thaliana (specie modello per le dicotiledoni) e quello di Oryza sativa (specie modello per le monocotiledoni) ha mostrato una maggiore complessità a livello di organizzazione genica per il genoma del riso e l’esistenza di set di geni specifici per le due specie. I geni specifici del genoma del riso riflettono l’evoluzione di nuove funzioni anatomiche, fisiologiche e di adattamento a diverse condizioni ambientali. Queste si riflettono nella creazione di nuovi geni – e quindi nuove funzioni proteiche – alla base di nuove potenzialità a livello cellulare, di organi o di specifici tessuti della pianta.

Genomica funzionale del riso
Negli ultimi cinque anni un notevole sforzo si è concentrato nello sviluppare strategie e tecnologie appropriate per definire la funzione dei circa 44.000 geni identificati nel genoma di riso dai progetti di sequenziamento sistematico (vedi sopra). La principale risorsa per la determinazione della funzione genica è la costituzione di collezioni di mutanti ottenuti mediante mutagenesi chimica, fisica o inserzionale. Lo sviluppo di tecnologie basate sulla PCR per l’identificazione di mutazioni puntiformi (di una singola base nucleotidica) quale il TILLING (acronimo di Targeting Induced Local Lesions In Genomes) o di delezioni (frammenti di DNA di alcune kilobasi) in uno specifico gene candidato, ha suscitato particolare interesse verso strategie non Ogm (organismi geneticamente modificati), basate su agenti mutageni classici (chimici e fisici) per identificare la funzione di specifici geni e correlarli al controllo di specifici caratteri di interesse agronomico. Per realizzare studi di genomica funzionale, si sono anche sviluppate strategie basate sulle attività di trasposoni e retrotrasposoni presenti nel genoma del riso. Tali trasposoni/retrotrasposoni – di cui il più noto è l’elemento Tos17 – sono sequenze di DNA in grado di spostarsi (evento di trasposizione) in diverse regioni cromosomiche e in tal modo causare l’inattivazione di specifici geni. È possibile, con metodologie di analisi genomica, reperire la posizione nel genoma in cui sono presenti tali trasposoni. L’inattivazione di geni causata da trasposoni/retrotrasposoni permette di definire la funzione di tali geni all’interno della cellula vegetale, dei tessuti della pianta e degli organi che la costituiscono. L’inattivazione di specifici geni infatti causa alterazioni a livello della regolazione o biosintesi di specifiche proteine necessarie al corretto funzionamento delle cellule dei vari tessuti e organi. È stato possibile creare collezioni di linee contenenti copie multiple del retrotrasposone Tos17 e mappare la loro posizione nel genoma di riso. A oggi sono disponibili più di 50.000 linee e sono state mappate circa 200.000 posizioni di retrotrasposoni Tos17 di cui circa il 30% è posizionato in porzioni del DNA contenenti geni. Tali linee si sono rivelate di estrema utilità per correlare alterazioni fenotipiche/ metaboliche all’inattivazione di specifici geni e definire in tal senso il loro specifico ruolo nello sviluppo o resistenza a stress biotici/ abiotici della pianta di riso. Un’iniziativa internazionale coordinata dai membri dell’International Functional Genomics Consortium (www.iris.irri.org) mira a creare linee mutanti per tutti i geni codificati nel genoma di riso. Come agenti mutageni per inattivare geni di riso si sono anche utilizzati trasposoni identificati in altre specie; è questo il caso dei sistemi Ac/Ds ed En/Spm di mais che sono stati trasferiti mediante trasformazione genetica nel riso. Tali trasposoni sono funzionanti nel riso e in grado di spostarsi in diverse posizioni del genoma inattivando specifiche sequenze geniche. I trasposoni vengono trasmessi da una generazione all’altra come il resto del genoma permettendo in tal modo di poter realizzare studi genetici di segregazione della presenza del trasposone in una specifica posizione e dei fenotipi osservati. Collezioni di mutanti generate con l’introduzione di tali trasposoni sono state create e caratterizzate a livello genomico per identificare in quali geni si sono inseriti. Linee mutanti stabilizzate sono a disposizione della comunità scientifiche per realizzare studi di caratterizzazione molecolare di specifiche classi di geni di riso e di correlazione gene-funzione.

Post genomica del riso

A oggi gli studi di genomica funzionale e comparativa tra i genomi di Arabidopsis e riso hanno permesso di assegnare la funzione a circa 15.000 geni del riso (40% del numero stimato di 44.000). Tuttavia per circa il 30% dei geni presenti nel genoma del cereale resta sconosciuto il loro ruolo a livello di regolazione o biosintesi di specifiche funzioni cellulari. Una porzione significativa di tali geni a funzione ignota è solo presente nel genoma del riso; essi codificano per proteine con funzioni specifiche al riso e ai cereali (molti dei geni riso-specifici sono infatti presenti anche nei genomi di mais, grano e orzo) e la loro analisi sistematica condurrà con molta probabilità alla scoperta di nuovi network di regolazione genica e di metabolismo cellulare. Le discipline della proteomica (studio della struttura delle proteine, delle loro modifiche e interazioni) e della metabolomica (studio della biosintesi di metaboliti sintetizzati dalle piante e del loro ruolo nelle cellule della pianta) assumeranno un ruolo determinante nel definire i meccanismi di interazione di specifiche funzioni geniche all’interno delle cellule. La bioinformatica assumerà un ruolo determinante nel garantire l’organizzazione, la consultazione e l’integrazione della miriade di dati genomici generati a livello internazionale. L’analisi dei dati genomici infatti permetterà di definire le basi molecolari di caratteri complessi, dei meccanismi che sottendono allo sviluppo o alla risposta e all’adattamento del riso a stress di tipo ambientale. Infine, la genetica comparativa è la scienza che mette a frutto i risultati derivati dagli studi di mappatura comparativa, termini assolutamente sconosciuti fino a pochi anni fa e che in questo ultimo periodo hanno assunto fondamentale importanza nella comprensione dei meccanismi che stanno alla base dei principali caratteri che fanno di una cultivar un genotipo vincente. L’ultimo di questi risultati deriva proprio dagli studi sul riso. Ricercatori di tre centri in Giappone a Nagoya, Yokohama e Chiba, in collaborazione con l’Istituto di Ricerca sul Riso di Hangzhou in Cina, hanno scoperto la base genetica dell’incremento della produttività. Infatti, è noto che molti tratti agronomicamente importanti delle piante coltivate sono sotto il controllo di QTL (Quantitative Trait Loci), che derivano da variazioni alleliche. I ricercatori hanno dimostrato che il QTL Gn1a nel riso, associato all’incremento produttivo del granello, è un gene che codifica un enzima coinvolto nel metabolismo ormonale della pianta, l’enzima citokinina ossidasi/reduttasi (OsCKX2), responsabile del catabolismo della citokinina. Una ridotta espressione del gene OsCKX2 causa un accumulo di citokinina nei meristemi delle infiorescenze, aumentando così il numero degli organi riproduttivi (spighette fiorali), che a loro volta si traducono in granelli, e quindi portano a un aumentato numero di semi per panicolo. Poiché altri QTL per altri tratti competitivi nel riso, come la ridotta taglia della pianta, sono noti, un lavoro di incrocio e selezione per la contemporanea compresenza dei due QTL nel genotipo corrispondente porta alla costruzione di un background genetico mirato per l’espressione dei due tratti importanti. La nuova varietà così ottenuta – mediante classico incrocio e selezione – produce il 25% in più di seme rispetto alla più produttiva varietà giapponese Koshihikari, che costituisce uno dei due parentali di partenza. Questi risultati, pubblicati sull’autorevole rivista internazionale Science, aprono nuovi orizzonti di immediata applicazione nella costituzione di nuove varietà competitive non solo nel riso ma anche nelle altre specie cereali e non.

 


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