Volume: gli agrumi

Sezione: ricerca

Capitolo: miglioramento genetico

Autori: Alessandra Gentile

Il miglioramento genetico delle piante coltivate è basato sulla scelta delle piante migliori all’interno di una popolazione variabile, ovvero, laddove non vi è variabilità, sulla possibilità di indurla utilizzando tecniche diverse. Il programma di miglioramento genetico può considerarsi concluso allorché vengono verificati in campo la stabilità dei caratteri e il comportamento bioagronomico complessivo del genotipo di nuova costituzione. Gli agrumi, nel loro complesso, sono caratterizzati da un’ampia variabilità genetica che è stata esplorata soltanto parzialmente e che è molto differente tra le diverse specie anche in funzione delle diverse caratteristiche riproduttive. A tale proposito basti citare l’alto grado di apomissia (formazione di embrioni senza che sia avvenuta la fecondazione) che contraddistingue il mandarino Cleopatra, portinnesto che si riproduce sempre per autoimpollinazione in condizioni naturali e che viene considerato pressoché omozigote, a differenza, per esempio, del clementine Comune, varietà autoincompatibile in cui si registra più del 50% di condizione eterozigote per tutti i geni. La maggior parte delle cultivar di agrumi si è originata da semina di fortuna o da mutazioni gemmarie insorte in cultivar già esistenti e, in linea generale, si può affermare che un numero relativamente esiguo di genotipi di un certo significato commerciale si è originato da programmi di incrocio e da mutagenesi indotta. Tuttavia, più recentemente, e in particolare per il comparto dei mandarinosimili, il numero di nuovi individui ottenuti mediante tali tecniche è cresciuto notevolmente anche in virtù di innovazioni agronomiche e tecnologiche che hanno consentito di migliorare l’efficienza e abbreviare i tempi per la valutazione dei nuovi genotipi. La realizzazione di programmi di miglioramento genetico degli agrumi basati sull’impiego dei metodi convenzionali è ostacolato da diversi aspetti della biologia fiorale che condizionano e limitano i successi conseguibili. Tra essi vanno menzionati:
– l’elevato grado di eterozigosi a cui si aggiunge la mancanza quasi totale di conoscenze sul controllo genetico di specifici caratteri, molti dei quali poligenici. Pertanto, la probabilità di ricombinare i geni desiderati di una cultivar di successo in un ibrido è veramente esigua e le popolazioni F1 che si ottengono sono caratterizzate da un’elevata segregazione dei caratteri; – la lunga fase giovanile dei semenzali zigotici e nucellari che rende estremamente lungo il periodo necessario per la valutazione e la selezione delle nuove varietà consentendo, di fatto, di analizzare solo la progenie F1 impedendo lo sviluppo di programmi più lunghi. Tale aspetto determina, altresì, la necessità di disporre di ampie superfici per la valutazione bioagronomica dei genotipi in esame. Inoltre, le caratteristiche dei frutti ottenuti dalla prima fioritura e fruttificazione del nuovo individuo non consentono di trarre indicazioni esatte in quanto spesso, in tale fase, esse si discostano ancora da quelle che saranno proprie dell’individuo adulto; – la sterilità, morfologica, citologica e fattoriale, parziale o totale di polline e ovulo che impedisce l’incrocio di alcuni genotipi quali le cultivar di arancio appartenenti al gruppo Navel, il pompelmo Marsh e i satsuma; – l’embrionia nucellare, cioè lo sviluppo di embrioni avventizi somatici da cellule della nucella, che determina la formazione di popolazioni di semenzali geneticamente identici al genitore femminile con conseguente mancanza della ricombinazione genetica. In alcuni incroci, infatti, nonostante i numerosi sforzi profusi, non si ottengono ibridi o quelli ottenuti sono troppo pochi per fornire una popolazione sufficientemente grande nell’ambito della quale poter ritrovare ricombinanti superiori. Questa difficoltà di incrocio assume maggiore significato per quelle specie in cui pochi o nessun genotipo monoembrionico sono disponibili, come per esempio in arancio e pompelmo.
Appare evidente, pertanto, che le peculiarità della biologia riproduttiva degli agrumi rendono il lavoro di miglioramento genetico particolarmente lento, complesso e costoso e tali difficoltà diventano ancora più significative per la costituzione dei portinnesti per i quali, ovviamente, sono anche da valutare, oltre all’affinità di innesto e all’influenza sull’habitus vegetativo delle principali cultivar, anche le modificazioni dei principali caratteri qualitativi dei frutti (colore, zuccheri, acidità ecc.). Proprio perché il portinnesto influenza in maniera significativa moltissime caratteristiche bioagronomiche e produttive delle varietà, il miglioramento genetico dei portinnesti ha un impatto elevato per il successo di un impianto agrumicolo. Tuttavia, nonostante le difficoltà, sostanziali progressi sono stati fatti nella costituzione di nuovi genotipi soprattutto nel gruppo dei mandarino-simili. L’adozione delle recenti biotecnologie, quali la variabilità somaclonale, l’ibridazione somatica e la trasformazione genetica, e la loro integrazione con gli strumenti di biologia molecolare (marcatori per la selezione precoce assistita e conoscenze derivanti dal sequenziamento dell’intero genoma aploide degli agrumi) nei programmi di miglioramento genetico offrono e offriranno sempre più strumenti rapidi ed efficienti per la costituzione di nuovi genotipi più rispondenti alle mutevoli richieste del consumatore, soprattutto in termini di salubrità e valore nutraceutico del frutto.

Obiettivi del miglioramento genetico degli agrumi

Definire i diversi obiettivi del miglioramento genetico degli agrumi è piuttosto complicato perché bisogna considerare una molteplicità di specie che vengono prodotte con finalità diverse (produzione per il consumo fresco, per il succo, a fini ornamentali, come portinnesti). Peraltro occorre ricordare come, alcune volte, obiettivi di grande valenza sono stati realizzati in maniera inconsapevole: si pensi a tal proposito alla costituzione dei portinnesti citrange Troyer e citrange Carrizo, originatisi da un incrocio tra Poncirus trifoliata e arancio dolce Washington Navel realizzato con l’obiettivo di trasferire il carattere di resistenza al freddo del Poncirus nell’arancio dolce. Gli ibridi ottenuti, invece, hanno manifestato un ottimo comportamento nei confronti della Phythophtora, agente del marciume del colletto degli agrumi, facendo presto assumere a tali portinnesti un ruolo di grande valenza, anche per la resistenza alla tristeza (CTV, Citrus Tristeza Virus) da essi manifestata ed ereditata dal genitore Poncirus. In linea generale, volendo distinguere tra le varietà e i portinnesti, gli obiettivi prioritari dei programmi di miglioramento genetico possono essere così schematizzati:

– varietà:
a) caratteristiche della pianta: precoce entrata in produzione, elevata produttività, costante produzione; b) caratteristiche del frutto: pezzatura, apirenia, contenuto in succo, epoca di maturazione interna ed esterna, facilità di sbucciatura per i mandarini, contenuto in solidi solubili totali, acidità del succo, resistenza del frutto maturo sull’albero, elevata resistenza in post-raccolta, contenuto in composti nutraceutici (vitamina C, antocianine ecc.);

– portinnesti:
a) caratteristiche della pianta: velocità di accrescimento, sviluppo dell’apparato radicale, adattabilità a condizioni pedologiche limitanti (contenuto in calcare, struttura e tessitura del suolo, salinità), adattabilità a condizioni climatiche avverse (resistenza alle gelate, all’aridità), resistenza a stress biotici (Phytophthora, Armillaria mellea, nematodi, virus e viroidi ecc.); b) caratteristiche dei frutti: elevata resa in semi poliembrionici.

Metodi di miglioramento genetico

Selezione clonale e nucellare
La maggior parte delle cultivar di agrumi oggi utilizzate ha avuto origine da mutazioni gemmarie sorte spontaneamente; la loro frequenza è piuttosto rilevante, soprattutto se si confronta con quella riscontrata in altri fruttiferi, e varia in funzione della specie e della cultivar: è più elevata nel satsuma, nell’arancio dolce e nel clementine di quanto non sia nel limone, nel cedro e nel pompelmo. L’insorgenza delle mutazioni è anche influenzata dalle condizioni ambientali e dalle pratiche colturali realizzate, per esempio la potatura, che determina lo sviluppo di gemme latenti e avventizie. Recentemente è stato dimostrato che almeno una delle cause responsabili di modifiche dell’assetto genetico delle piante di agrumi è rappresentata dalla presenza di elementi trasponibili abbondantemente distribuiti sui cromosomi che, in seguito al verificarsi di alcune condizioni, saltano su regioni nuove del cromosoma, impedendo o modificando l’espressione dei geni dove questi si inseriscono, e, pertanto, determinando l’insorgenza di nuovi caratteri. Il processo di selezione prevede, dopo aver individuato la mutazione di interesse, il prelievo della marza del ramo mutato e il conseguente innesto per la valutazione dell’uniformità delle caratteristiche rilevate per alcuni anni (2-3). Avuta la certezza della stabilità della modificazione insorta, il nuovo genotipo viene risanato attraverso la tecnica del microinnesto e la nuova varietà viene innestata su diversi portinnesti per una valutazione complessiva. Non tutte le modificazioni individuate portano al rilascio di un nuovo genotipo. Infatti, in agrumicoltura è piuttosto comune il verificarsi di un fenomeno noto con il termine di “chimera” che consiste nella contemporanea presenza di tessuti di differente costituzione genetica; in realtà tale fenomeno può anche originarsi per irregolarità dei processi mitotici o per effetto dell’innesto. Le chimere possono essere autogene o sintetiche. Nel primo caso la modificazione riguarda una cellula dell’apice vegetativo e, in funzione dello strato istogeno che è interessato, si parla di mutazioni periclinali, mericlinali e settoriali. Le chimere sintetiche invece non riguardano una modificazione dell’assetto genetico della cellula dell’apice meristematico, ma si originano in seguito allo sviluppo di gemme avventizie nel punto di innesto di due bionti. Pietro Nati nel 1624 ha descritto la “bizzarria” che successivamente Tanaka (1927) identificò come composta da una parte interna di cedro e uno strato esterno di arancio amaro. Nel complesso, l’insorgenza di tali chimere di innesto è rara e non ha rilevanza sul piano applicativo. Nelle forme chimerali di tipo periclinale o mericlinale le modificazioni non vengono trasmesse per seme rendendo, pertanto, instabili tali forme; per esempio, è stato riportato che piante diverse di arancio Shamouti producono semenzali con caratteristiche rispondenti al tipo e semenzali, invece, con caratteristiche tipiche dell’arancio Beledi. Tale fenomeno è legato, infatti, all’origine chimerale dell’arancio Shamouti che ha avuto origine, probabilmente, come mutazione senza semi insorta in una branca di arancio Beledi. Un altro esempio di tale tipo è la produzione di frutti cosiddetti “apiati” (erroneamente attribuita alla puntura delle gemme da parte delle api) in piante di arancio Ovale le cui caratteristiche sono riconducibili a quelle del Biondo Comune. Diversi sono i casi riportati in letteratura e che riguardano la comparsa di piante con caratteri ancestrali come, per esempio, piante con frutti di tipo cedro in limone Villafranca. È comunque importante sottolineare come tutte le cultivar che presentano un’origine chimerica siano instabili; una possibilità per la selezione soltanto dei tipi con le caratteristiche mutate può essere rappresentata dall’isolamento di semenzali nucellari ottenuti anche mediante l’impiego di tecniche di coltura in vitro. La maggior parte delle modificazioni genetiche che si verifica in natura è peggiorativa e può determinare uno scadimento delle caratteristiche delle cultivar interessate. Risulta fondamentale, pertanto, in questo caso, individuarle ed eliminarle con la potatura per mantenere lo standard varietale. Nonostante la selezione di nuovi genotipi attraverso l’insorgenza di mutazioni spontanee sia certamente un processo lungo e difficile, essa rappresenta senza dubbio il metodo più utilizzato per il miglioramento genetico degli agrumi, probabilmente perché consente di mantenere la maggior parte delle caratteristiche originarie negli individui che mutano e perché essi non devono superare la fase giovanile tipica dei semenzali per essere valutati nelle caratteristiche qualitative dei frutti. L’origine, per esempio, dell’arancio Washington Navel e di tutti i relativi mutanti precoci (Naveline, Newhall) e tardivi (Chislett, Powell ecc.) nella maturazione è a carico dell’arancio Selecta in cui è insorta la mutazione relativa alla formazione del navel (ombelico) nel frutto. Anche la moltitudine di clementine oggi disponibili caratterizzati da epoche diverse di maturazione (da quelli molto precoci ai tardivi) si è originata a partire dal clementine Comune a seguito di mutazioni gemmarie, così come i numerosissimi cloni di arancio Tarocco diversificati per morfologia del frutto, caratteristiche qualitative ed epoca di maturazione. La selezione nucellare è stata molto utilizzata nel passato per il risanamento dalle malattie da virus. Essa consiste nel propagare i semenzali nucellari ottenuti dalle cultivar poliembrioniche che risultano essere virus-esenti. Tuttavia, le piante nucellari presentano caratteri giovanili quali l’eccessiva spinescenza, che si mantiene anche dopo diversi cicli di innesto, il ritardo della messa a frutto e l’insoddisfacente qualità dei frutti durante i primi anni di fruttificazione. Attraverso la selezione nucellare è stato possibile ottenere linee nucellari delle più importanti cultivar di arancio, mandarino e pompelmo, mentre risultati poco significativi si sono registrati per il limone in quanto i cloni nucellari sono risultati più suscettibili al malsecco delle vecchie linee. Oggi per il risanamento delle varietà dalle malattie da virus si utilizza il microinnesto.

Ibridazione
Oltre alla sterilità gametica, gli agrumi sono caratterizzati da fenomeni di auto- e interincompatibilità che, se da un lato pongono problemi nel momento in cui si vogliono realizzare degli incroci, dall’altro offrono l’opportunità di produrre frutti apireni grazie alla spiccata tendenza alla partenocarpia. È stato ipotizzato che l’autoincompatibilità fosse determinata dalla presenza dell’allele Sf autocompatibile dominante. Recentemente, l’analisi di progenie ottenute da incroci tra satsuma e diverse cultivar di mandarino autoincompatibili (Fortune, Ellendale) e autocompatibili (Murcott, Wilking) quali donatori di polline ha portato alla verifica di rapporti di segregazione che hanno consentito di ipotizzare che il satsuma abbia un allele autocompatibile e uno autoincompatibile, confermando, pertanto, il modello precedentemente proposto. Negli ultimi anni, uno studio agronomico, istologico e molecolare ha evidenziato i rapporti di interazione tra polline e pistillo in genotipi auto- e intercompatibili durante il percorso del polline all’interno dello stilo. Sono stati altresì individuati alcuni geni candidati coinvolti nel meccanismo dell’incompatibilità. L’autoincompatibilità è assai frequente nel pummelo, limone, clementine e in alcuni tangeli. La presenza di tale carattere è assai difficile da predire in molte progenie considerando il ruolo che i diversi ancestrali hanno avuto nella costituzione genetica dei genitori. Tutte le specie appartenenti al genere Citrus sono intercompatibili ed è possibile anche l’ibridazione con altri generi affini quali Fortunella e Poncirus. Pertanto l’incrocio ha rappresentato e rappresenta tuttora una delle strategie più utili per l’induzione di nuova variabilità. Gli incroci naturali, spesso aiutati dalla diffusione operata dall’uomo del germoplasma agrumicolo, e la successiva selezione, naturale o artificiale, sono stati responsabili dell’evoluzione del genere Citrus attraverso la costituzione di numerose specie che combinano diverse caratteristiche delle specie considerate originarie degli agrumi coltivati. La lunga fase giovanile, tipica dei semenzali zigotici e nucellari, è tuttavia uno dei principali ostacoli che si incontrano nello svolgimento di programmi di incrocio. Il raggiungimento della fruttificazione, tuttavia, che si consegue più lentamente in arancio di quanto non avvenga nella maggior parte delle cultivar di mandarino, non determina anche la scomparsa di altre caratteristiche morfologiche tipiche dello stadio giovanile, quale l’elevata spinescenza, che può mantenersi per diversi anni. La durata della fase giovanile dipende molto dal genotipo e recenti ricerche hanno concluso che essa è sotto il controllo di diversi geni. L’incrocio sessuale controllato, quale metodo di miglioramento genetico, è certamente un processo lungo che prosegue per passaggi successivi che vanno dalla demasculazione del fiore della varietà selezionata, prima che il proprio polline sia maturo, all’isolamento con tessuto non tessuto per evitare la fecondazione incontrollata, all’impollinazione controllata con il polline della varietà donatrice prescelta opportunamente raccolto sui fiori già demasculati, al recupero all’individuazione e alla selezione degli embrioni zigotici, all’allevamento di moltissimi semenzali e, infine, alla selezione dei tipi migliori. I semenzali ottenuti vengono innestati su portinnesti vigorosi al fine di ridurre i tempi per la valutazione delle caratteristiche dei frutti. Al fine di individuare gli individui zigotici, l’utilizzo del genitore femminile clementine monoembrionico ha rappresentato il metodo più utilizzato, anche se oggi la disponibilità di tecniche di analisi del DNA rendono possibile conoscere con certezza l’origine dei semenzali in epoca assai precoce. Inoltre, la popolazione di semenzali che si ottiene può presentare caratteristiche intermedie a quelle dei genitori, alcuni caratteri propri di uno solo dei genitori, nuovi caratteri che non sono presenti in nessuno dei due genitori oppure caratteristiche che erano presenti nelle forme ancestrali. Pertanto, da un lavoro di ibridazione verranno selezionati soltanto quegli individui che presenteranno caratteristiche specifiche migliorative rispetto a quelle di ciascuno genitore. Nel complesso gli ibridi di agrumi possono essere così classificati:
– intraspecifici: sono incroci realizzati tra cultivar appartenenti alla stessa specie; – interspecifici: sono ibridi ottenuti per incrocio tra specie appartenenti allo stesso genere. Molti ibridi interessanti da un punto di vista commerciale appartengono a questa categoria e precisamente: i tangeli (Citrus reticulata x C. paradisi) e i tangor (C. reticulata x C. sinensis); – intergenerici: sono difficili da ottenere anche se, allorché l’incrocio è coronato da successo, gli ibridi sono vigorosi; alcuni di questi ibridi hanno un’importanza assai rilevante quali portinnesti (citrange e citrumelo); – ibridi complessi: si originano a seguito di incroci tra ibridi interspecifici o intergenerici e sono il risultato di due o più incroci.

In realtà, l’incrocio sessuale non ha contribuito in maniera sostanziale alla costituzione di cultivar di interesse nell’arancio dolce, nel pompelmo, nel limone e nella lima. Per quanto riguarda il limone, bisogna sottolineare che, con lo specifico obiettivo di trasferire il carattere di resistenza al malsecco in cultivar con buone caratteristiche agronomiche, sono stati eseguiti, in Italia e in altri paesi del bacino del Mediterraneo, a partire dal 1946, numerosi incroci tra specie e cultivar diverse, ma sino a oggi non è stato possibile selezionare alcun genotipo dotato sia di tolleranza al patogeno sia di adeguate caratteristiche bioagronomiche. Nell’ambito, invece, del complesso gruppo dei mandarini, l’incrocio sessuale ha consentito di ampliare fortemente la piattaforma varietale. I numerosi tangor e tangeli oggi ampiamente diffusi provengono da specifici programmi di ibridazione realizzati presso le diverse istituzioni scientifiche operanti in campo nazionale e internazionale. Numerosi ibridi intergenerici e interspecifici sono stati costituiti per il raggiungimento di specifici obiettivi. Tra questi il mandarino Primosole, ottenuto dall’incrocio tra il mandarino Avana e il satsuma Miyagawa, ha avuto una notevole diffusione in Italia e in Spagna per la precocità di maturazione e l’apirenia dei frutti. Più recentemente l’attenzione dei ricercatori in diverse regioni agrumicole si è concentrata sulla costituzione di individui triploidi, importanti perché sterili e pertanto caratterizzati da produzione di frutti apireni. La lima acida Bearss (Citrus x latifolia) è un ibrido naturale triploide originatosi presumibilmente da un incrocio tra una lima e un altro agrume che presenta sterilità dell’ovulo e che pertanto produce frutti apireni. I primi genotipi triploidi costituiti per incrocio artificiale sono stati l’Oroblanco e il Melogold, ottenuti dall’incrocio tra un genitore femminile 4x (pummelo Chandler) e uno maschile 2x (pompelmo Duncan). Altri ibridi triploidi costituiti da oltre 25 anni hanno una notevole importanza commerciale; tra essi, per esempio, il mandarino Winola rinvenuto in Israele da un incrocio tra il mandarino Wilking e il tangelo Minneola. In Italia, il CRA-ACM di Acireale ha svolto nell’ultimo ventennio un intenso lavoro di ibridazione utilizzando un genitore femminile diploide monoembrionico (al fine di essere certi sulla natura ibrida degli embrioni ottenuti) e individui maschili tetraploidi. Dalle diverse combinazioni di incrocio che sono state realizzate e che hanno riguardato diverse specie quali arancio dolce, clementine, pummelo, limone e cedri, è emerso chiaramente che le caratteristiche più importanti del frutto risultano fortemente influenzate dal genitore maschile utilizzato nell’incrocio. Nell’ambito di tutti gli ibridi ottenuti da tale programma, alcuni di essi, già in valutazione, hanno fatto registrare buone caratteristiche sia in termini di produttività sia di qualità dei frutti. Anche in Spagna sono stati recentemente costituiti interessanti ibridi triploidi (Safor, Garbì). Alla luce delle difficoltà biologiche e dei lunghi tempi necessari per l’ottenimento e la valutazione degli ibridi, appare chiaro che i programmi di miglioramento genetico basati sull’incrocio consentono di valutare al massimo le progenie F1.

Mutagenesi indotta
La possibilità di indurre mutazioni mediante irraggiamento con agenti fisici (radiazioni ionizzanti quali raggi gamma, x, UV ) o chimici (trattamenti con colchicina, con EMS ecc.) rappresenta un metodo potente per la produzione di nuova variabilità all’interno della quale, successivamente, operare un’adeguata selezione. Comunque essa venga provocata, la mutazione, a differenza di quello che avviene mediante l’incrocio, può interessare uno qualunque dei 100.000 o più geni del genoma nucleare e anche alcuni di quelli presenti negli organelli citoplasmatici. Ciò significa che la variabilità che viene così determinata è estremamente più ampia e può portare a una modificazione anche in quei geni (geni ubiquitari) che sono in comune tra tutte le varietà di una specie. Anche questo metodo di miglioramento genetico presenta alcune limitazioni. L’azione dell’agente mutageno non può essere determinata a priori e, pertanto, essere diretta nei confronti di uno specifico gene; ciò significa, in altri termini, che l’alterazione a carico del cromosoma è assolutamente casuale e può determinare l’insorgenza di caratteristiche indesiderate e la successiva necessità di analizzare una grande popolazione di mutanti all’interno dei quali operare la selezione. Inoltre, tali mutazioni possono non essere stabili nel tempo. La modificazione determinata dal fattore mutageno nei confronti della struttura molecolare del DNA può essere resa vana dal ripristino della struttura originaria in seguito a ulteriori mutazioni geniche, traslocazioni e aberrazioni cromosomiche, che insorgono prima ancora che la mutazione sia manifesta ed espressa fenotipicamente. Ovviamente, la maggior parte delle alterazioni positive indotte nel genoma di un organismo causano, comunque, disturbi nel sistema generale così altamente sofisticato, bilanciato e sinergico. La mutagenesi indotta può portare anche alla produzione di chimere settoriali e mericlinali, cioè alla produzione di mutazioni che, in dipendenza della proporzione del settore mutato e dello strato di cellule interessato, possono essere instabili. Grande attenzione nell’impiego di tale metodo deve essere rivolta all’adozione di particolari accorgimenti volti a ridurre la probabilità di insorgenza di tale fenomeno e, a tal fine, è preferibile selezionare i potenziali mutanti nella seconda generazione dall’evento di mutagenesi. Questo metodo di miglioramento genetico può rappresentare un sistema particolarmente interessante per ottenere nuove cultivar, specialmente nel caso dell’arancio dolce e del pompelmo che non si prestano a essere modificati mediante l’incrocio. La grande variabilità di genotipi commercialmente importanti che sono stati ottenuti in seguito all’insorgenza di mutazioni naturali ha stimolato fortemente l’impiego delle sostanze mutagene per il raggiungimento di specifici obiettivi. Un intenso lavoro di miglioramento genetico attraverso la mutagenesi indotta è stato svolto nell’ultimo trentennio in Israele e più recentemente in Sud Africa e in altri Paesi agrumicoli e sono stati rilasciati numerosi genotipi, la maggior parte dei quali appartenenti al gruppo dei mandarini. Il primo genotipo costituito utilizzando tale tecnica è stato il pompelmo Star Ruby, selezionato da Hensz in Texas nel 1970 in seguito al trattamento con neutroni termici di semi di pompelmo Hudson nel 1959. La selezione ottenuta era contraddistinta dal colore particolarmente rosso della polpa (dovuto all’accumulo di licopene, pigmento tipico del pomodoro) e dalla minore acidità del frutto. Cloni senza semi sono stati ottenuti per l’arancio Pineapple, per i pompelmi Duncan e Foster, per il clementine Monreal e per il limone Eureka a partire da gemme ascellari o semi delle rispettive cultivar con semi. In Italia, giovani frutticini di limone Femminello siracusano sono stati irradiati con raggi gamma e gli ovuli non sviluppati da essi prelevati sono stati coltivati in vitro. Da tale programma è stato selezionato un mutante, denominato Femminello 2KR, che manifesta breve durata della fase giovanile, assenza di spine e precoce entrata in produzione associata a ottime caratteristiche qualitative dei frutti. Recentemente grande attenzione è riservata ad alcuni mandarini simili, ottenuti per irraggiamento con Cobalto 60 di gemme di varietà di buone caratteristiche ma dotate di semi; tra questi, per esempio, il mandarino Michal, privo di semi rispetto alla varietà originaria. Il trattamento con tale agente mutageno ha consentito di ottenere i rispettivi mutanti apireni, tra i quali il Tango, ottenuto in California a partire da W. Murcott (Nadorcott), e il Mor, ottenuto in Israele per irraggiamento del mandarino Murcott.

Biotecnologie innovative

Le biotecnologie innovative hanno fatto registrare nell’ultimo decennio un notevole sviluppo e offrono potenzialità per il superamento o, comunque, l’attenuazione di alcune problematiche connesse con lo sviluppo di programmi di miglioramento genetico degli agrumi. Nell’ambito del complesso ventaglio di tecniche disponibili, esse possono essere fondamentalmente raggruppate in due categorie, ciascuna delle quali deve essere considerata di supporto ai metodi classici di miglioramento genetico.

Biotecnologie per l’ottenimento di nuova variabilità
Esistono alcune moderne tecnologie che consentono di generare nuova variabilità allorché questa non è disponibile all’interno di una specifica varietà o perché mediante i metodi tradizionali non è possibile indurla. Tali metodi vengono indicati come “metodi parasessuali” in contrapposizione a quelli sessuali. Tra essi, vengono ricordati, perché più ampiamente utilizzati: – la variabilità somaclonale (compresa la selezione in vitro); – l’ibridazione somatica; – la trasformazione genetica. Il primo metodo si riferisce alla possibilità di generare variabilità in tessuti vegetali, allevati in vitro; tale variabilità può avere origini diverse: essa può insorgere spontaneamente proprio in funzione del metodo di coltivazione artificiale (è tanto più frequente quanto più il metodo di coltivazione in vitro prevede il passaggio da una fase di coltura di callo), può essere già presente nel tessuto che si mette in coltura e pertanto l’allevamento in vitro ne consente soltanto la manifestazione, ovvero può essere indotta mediante l’impiego di fattori di stress che determinano l’insorgenza di mutazioni. Quest’ultimo metodo ha consentito di selezionare linee cellulari di agrumi che hanno manifestato tolleranza ad alcuni agenti di stress biotici o abiotici (filtrati colturali di Phoma tracheiphila e Phytophthora citrophthora, alte concentrazioni di NaCl ecc.). L’ibridazione somatica consiste nell’isolare e unire due protoplasti (cioè cellule private della parete cellulare) mediante un processo fisico o chimico. È un metodo che consente di superare qualunque problema legato all’incompatibilità sessuale tra i genitori che si vogliono unire, dal momento che le cellule utilizzate per la fusione sono prelevate dal soma della pianta e non dalla linea gamica. Consente, inoltre, di realizzare non un rimescolamento del patrimonio genetico dei due partner della fusione, bensì un’addizione dei due genomi (sia nucleare che citoplasmatico) con un risultato che è ben diverso da quello conseguibile mediante l’incrocio sessuale. Il limite di tale tecnica risiede nel fatto che, sebbene teoricamente sia possibile ottenere protoplasti da qualunque individuo, è più difficile disporre di un metodo di rigenerazione in vitro a partire da cellule isolate. Inoltre, diventa difficile da prevedere quale nuovo assetto genetico si avrà nell’ibrido costituito; esso potrà avere, in funzione del fatto che la fusione sia simmetrica o asimmetrica, un corredo genetico tetraploide o diploide. È stato dimostrato che individui tetraploidi posseggono caratteri complementari a quelli dei genitori così come individui diploidi – ottenuti attraverso un procedimento donatore-ricevente mediante il quale un genitore dona il DNA nucleare e l’altro quello citoplasmatico e noti con il termine di cibridi – posseggono tipi di DNA mitocondriale diversi da quelle presenti nei due genitori. Quest’ultima applicazione dell’ibridazione somatica ha senza dubbio una valenza maggiore della produzione di individui tetraploidi perché consente di ottenere cibridi con una morfologia propria del genitore che fornisce il DNA nucleare e con un riassortimento del DNA citoplasmatico che, come dimostrato in altre specie, è depositario di geni assai importanti quali quelli che codificano per la resistenza a stress di natura biotica e abiotica. Il numero di ibridi somatici fertili (4n=4x) è in continuo aumento e numerosi sono i casi di individui costituiti a partire da genitori anche sessualmente incompatibili e appartenenti a generi distanti tra loro come Citrus e Severinia. L’università della Florida, e più precisamente il Citrus Research Education Center, ha prodotto un grande numero di ibridi somatici soprattutto con riferimento alla costituzione di portinnesti, il cui giudizio complessivo dovrà tenere conto della loro fertilità, e di nuove cultivar di arancio dolce allotetrapoidi sviluppate per essere utilizzate quali partner nell’incrocio con diploidi al fine di ottenere individui triploidi. L’induzione di nuova variabilità, in maniera mirata e specifica, può certamente essere conseguita con l’applicazione della trasformazione genetica. Tale tecnica consente di aggiungere un carattere specifico a una cultivar o a un portinnesto senza modificare il patrimonio genetico complessivo, evitando l’insorgenza di caratteri non desiderati e senza dover sottostare ai lunghi tempi richiesti dai cicli di reincrocio necessari allorché si vuole trasferire un carattere mediante i metodi sessuali. I metodi per la trasformazione genetica sono diversi, ma certamente quello più ampiamente impiegato prevede l’utilizzo di un vettore per il trasferimento della sequenza genica che si vuole inserire. È un metodo che non ha barriere né sessuali né filogenetiche; così geni isolati da batteri, funghi, virus e quant’altro possono essere inseriti nel genoma di un vegetale. Numerosi sono gli esempi di trasformazione genetica degli agrumi che fanno principalmente riferimento all’introduzione di geni per ottenere resistenza a stress biotici, in particolare al virus della tristeza, per modificare l’habitus vegetativo della pianta, per ridurre il numero di semi e il periodo giovanile dei semenzali, per indurre resistenza ad alcuni funghi ecc. Tuttavia, per completare il processo di trasformazione genetica è necessario disporre di un metodo efficiente di rigenerazione in vitro che, di fatto, ha fortemente limitato il numero di specie che sono state oggetto di trasformazione. Molte sperimentazioni, infatti, sono state condotte impiegando soltanto alcune specie considerate modello, quali i citrange Troyer e Carrizo e alcune varietà di arancio. Numerosi laboratori sono impegnati nell’affinamento dei metodi di trasformazione genetica per un grande numero di specie di agrumi, anche se oggi il limite più importante è rappresentato dalla mancanza di disponibilità di geni agronomicamente importanti, identificati, isolati e clonati da specie quanto più vicine a quelle che si vogliono trasformare.

Biotecnologie per una selezione più rapida ed efficace
All’interno di un programma di miglioramento genetico è fondamentale contare su un metodo di selezione efficiente che consenta di individuare, in tempi rapidi e con scarsi margini di errore, gli individui che non possiedono le caratteristiche desiderate. Allorché si esegue un programma basato sull’incrocio, per esempio, diventa indispensabile poter individuare rapidamente gli individui di origine nucellare da quelli zigotici. A tale proposito, nel passato l’impiego di genotipi con caratteristiche morfologiche dominanti (quali la foglia trifogliata) rappresentava un valido aiuto per tale finalità. Oggi le tecniche di analisi del DNA ci consentono – utilizzando quantità assai limitate di tessuto – di distinguere gli individui sulla base delle loro differenze genetiche. Numerose sono le tecniche che già esistono e continuamente delle nuove ne vengono messe a punto rendendo il settore dei marcatori molecolari uno di quelli più dinamici tra tutti quelli biotecnologici. I marcatori molecolari possono essere di supporto in molte fasi dei programmi di miglioramento genetico condotto con le tecniche convenzionali, potendo contribuire alla scelta mirata dei genitori fino alla selezione precoce dei semenzali, consentendo di accelerare notevolmente le procedure classiche di selezione, specie per quei caratteri che si rivelano con difficoltà o che si esprimono solo dopo il superamento della fase giovanile. I marcatori costituiscono, infine, un mezzo molto efficace per la realizzazione delle mappe genomiche che rappresentano uno strumento importante per l’isolamento e il clonaggio dei geni, per agevolare la selezione assistita di nuovi genotipi ottenuti con metodi diversi. Le informazioni sulle sequenze del genoma di agrumi, e in particolare per quelle che codificano per specifici caratteri, sono piuttosto esigue a confronto con altre specie erbacee e arboree. Con la finalità di ampliare le informazioni sulla genomica degli agrumi, nel 2004 è stato costituito un consorzio denominato International Citrus Genome Consortium, al quale partecipano i principali Paesi agrumicoli coinvolti negli studi molecolari sugli agrumi che hanno sequenziato il genoma del clementine.

 


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