Volume: il pomodoro

Sezione: ricerca

Capitolo: genomica

Autori: Luigi Monti, Stefania Grillo

Introduzione

Nel pomodoro, così come in altre specie vegetali, i recenti progressi delle conoscenze di genetica e biologia hanno spostato l’interesse dei genetisti dallo studio dei singoli geni a quello dell’intero patrimonio genetico e visto l’affermarsi di nuove strategie di ricerca basate su approcci di genomica strutturale e funzionale. Gli studi genomici stanno rivoluzionando diversi settori delle scienze agrarie permettendo una visione integrata e globale dei meccanismi fisiologici, biochimici e genetici che regolano la crescita e la produttività delle piante e lo sviluppo di nuovi strumenti per accelerare e rendere più mirato il miglioramento genetico delle piante agrarie.

Sequenziamento del genoma del pomodoro: stato attuale

Il pomodoro (Solanum lycopersicum) è oggi una delle specie vegetali più studiate a livello genetico e genomico, non solo a causa della sua notevole importanza economica, ma anche perché possiede un genoma relativamente piccolo (950Mb), il che ha contribuito a farne un sistema modello anche per altre specie in generale e per tutta la famiglia delle Solanaceae in particolare. Il pomodoro è oggetto di un progetto internazionale per il sequenziamento dell’intero genoma (International Solanaceae Genome Project, SOL) che coinvolge dieci Paesi, tra i quali l’Italia, a cui è affidata la determinazione della sequenza nucleotidica del cromosoma 1. Per il sequenziamento è stata adottata la strategia BAC-by-BAC (Bacterial Artificial Chromosome), già impiegata con successo nel sequenziamento di altri genomi quali quelli di Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Genome Initiative) e del riso (International Rice Genome Sequencing Project). Nell’ottobre 2008 erano disponibili nella banca dati GenBank ben 1095 sequenze BAC, equivalenti a ~120 Mb che hanno permesso il completamento del primo draft del genoma da parte del consorzio internazionale. Con l’affermarsi delle cosiddette tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (Roche 454, Illumina Solexa, Applied Biosystem SOLiD) si sono rese disponibili valide alternative strategiche e tecnologiche per il sequenziamento del genoma di pomodoro ed è stata quindi lanciata una nuova iniziativa di sequenziamento dell’intero genoma mediante un approccio whole genome shotgun. L’integrazione dei dati ottenuti con tali approcci (454 shotgun) con i risultati già disponibili ottenuti con la strategia BAC-by-BAC, ha permesso il recente annuncio (nel dicembre 2009) del rilascio in rete di una versione preliminare dell’intera sequenza del genoma di pomodoro. Il consorzio International Tomato Annotation Group è al momento al lavoro per lo sviluppo e l’utilizzazione di strumenti bioinformatici avanzati per un’annotazione completa e di alta qualità dell’intero genoma che sarà disponibile alla comunità internazionale nei primi mesi del 2010. La determinazione della sequenza completa del genoma di pomodoro e la conseguente annotazione genica rappresenterà uno strumento formidabile per l’analisi dell’organizzazione e della funzionalità del genoma, per la comprensione dei meccanismi evolutivi alla base della diversificazione dell’intera famiglia delle Solanaceae e per lo sviluppo di strumenti avanzati per l’industria agro-alimentare.

Risorse per l’analisi strutturale e funzionale del genoma di pomodoro

L’interesse scientifico ed economico del pomodoro ha reso possibile negli ultimi anni lo sviluppo di una vasta rete internazionale di gruppi di ricerca (Solanaceae Genomics Network) che condividono le numerose risorse sviluppate per questa specie attraverso un sito web dedicato alla raccolta, organizzazione e distribuzione alla comunità scientifica di informazioni, strumenti e risultati utili per l’analisi genetica e genomica nel pomodoro e in altre specie affini (patata, melanzana, peperone, tabacco ecc.). Anche la comunità scientifica italiana è molto attiva nel settore della genetica e genomica del pomodoro ai cui studi sono stati recentemente dedicati importanti finanziamenti pubblici. Inoltre è stato recentemente costituito il Laboratorio Pubblico-Privato di Genomica per l’innovazione e la valorizzazione della filiera del pomodoro (GenoPOM) dove sono concentrate alte competenze scientifiche e tecnologiche insieme ad avanzate risorse logistico-strumentali di genomica esclusivamente impegnate nello studio e nell’analisi del genoma del pomodoro. Gli strumenti genomici recentemente sviluppati per il pomodoro, la maggior parte dei quali sono attualmente disponibili pubblicamente attraverso l’SGN, includono: dettagliate mappe genetiche e fisiche; ampie e caratterizzate collezioni di specie selvatiche e di mutanti, naturali o indotti per via chimica o fisica, incluse popolazioni messe a punto per la genomica funzionale, per esempio mutanti ottenuti per activation tagging e TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes); vaste collezioni di Expressed Sequence Tags (EST); popolazioni di linee recombinant inbred (RI), linee quasi isogeniche (NIL) e linee di introgressione (IL); piattaforme di analisi trascrittomica, protetomica e metabolomica, piattaforme bioinformatiche per la gestione e integrazione dei dati. Le risorse sviluppate fanno del pomodoro una delle specie vegetali maggiormente caratterizzate e sono ampiamente utilizzate sia per studi di biologia e genetica di base sia per scopi applicativi d’interesse commerciale. Di seguito sarà brevemente accennato allo sviluppo e all’utilizzazione di tali risorse.

Sviluppo e uso di marcatori molecolari e mappe genetiche

Una delle applicazioni più efficaci delle conoscenze di genomica è lo sviluppo di marcatori molecolari da utilizzarsi per la selezione assista (Marker Assisted Selection, MAS) di genotipi superiori ai fini del miglioramento genetico vegetale. Il pomodoro è una delle specie con il maggior numero di marcatori sviluppati (SSR, RFLP, SNP e altri) e nella banca dati del SGN sono oggi disponibili dati su circa 15.000 marcatori con informazioni, facilmente interrogabili on line, sulla sequenza e la localizzazione sulla mappa. Grazie all’ausilio dei marcatori molecolari, negli ultimi 15 anni è stato possibile localizzare numerosi geni d’interesse agronomico, tra cui più di 30 geni di resistenza a patogeni. Le conoscenze acquisite sono oggi utilizzate di routine dalle aziende sementiere per la selezione assistita da marcatori di genotipi resistenti in cui resistenze multiple sono piramidalizzate in modo mirato. Il grande numero di marcatori disponibili ha permesso inoltre l’affermarsi di studi genomici comparativi tra le diverse specie di pomodoro e del genere Solanum. Le analisi comparative hanno evidenziato che i genomi di pomodoro e patata differiscono solo di 5 inversioni pericentriche (in cui è interessato il centromero e sono coinvolti entrambi i bracci cromosomici) mentre il pomodoro e il peperone sono caratterizzati da ristrutturazioni causate sia da traslocazioni sia da inversioni. La disponibilità di grandi quantità di dati di sequenza delle diverse specie vegetali sta permettendo inoltre lo sviluppo e la mappatura di marcatori di tipo COS (Consensus Ortologous Set) condivisi da più specie e che sono ideali per ampi e precisi studi di genomica comparativa e di sintenia tra specie diverse e taxa non correlati. È da sottolineare l’estrema utilità anche ai fini applicativi delle conoscenze genomiche e della disponibilità di un ampio numero di marcatori. Questi infatti rappresentano uno strumento formidabile per la tracciabilità dei prodotti della filiera pomodoro (polpa, pelato, salsa, prodotto fresco) e la certificazione dei semi che già oggi le industrie sementiere e per quelle di trasformazione utilizzano con sicurezza vista la disponibilità di procedure standard e applicabili su larga scala.

Sviluppo e uso di approcci per i caratteri quantitativi

In pomodoro la disponibilità di mappe di associazione molto sature di marcatori ha promosso la loro utilizzazione per l’identificazione di loci per caratteri quantitativi (Quantitative Trait Loci, QTL) che regolano importanti funzioni quali la produttività, la tolleranza a stress ambientali, la morfologia e qualità dei frutti, il contenuto in metaboliti secondari e vitamine. Tali studi, condotti su popolazioni provenienti da incroci interspecifici tra la specie coltivata (Solanum lycopersicum) e le specie selvatiche (S. pennellii, S. habrochaites, S. peruvianum e altre) di pomodoro, hanno inoltre evidenziato che specifiche combinazioni alleliche putativamente favorevoli sono presenti nelle specie selvatiche e che possono dare origine, se introgresse nelle varietà di pomodoro, a genotipi con caratteristiche superiori. Tali osservazioni hanno indotto il recente sviluppo di nuove strategie innovative per il miglioramento genetico assistito di caratteri quantitativi basate su analisi QTL utilizzando la variabilità genetica presente nel germoplasma selvatico. Una delle strategie di maggior successo è basata sull’uso di popolazioni di linee di introgressione (IL) derivate da incroci interspecifici che consentono di avere una collezione permanente di segmenti cromosomici omozigoti di una specie selvatica nel background genetico della specie coltivata. La natura permanente di queste linee consente inoltre che diversi laboratori possano raccogliere dati dalle stesse linee e ripetere le prove più volte sia nel tempo sia nello spazio, presupposto fondamentale per lo studio dei caratteri quantitativi. Le popolazioni di IL, e in modo particolare quella di S. pennellii (LA716), sono state utilizzate per diversi scopi tra cui la mappatura di 130 QTL per un totale di 38 caratteristiche correlate alla qualità del frutto di pomodoro. L’approccio del breeding assistito basato sull’uso delle IL ha dimostrato grosse potenzialità applicative per il miglioramento genetico del pomodoro; infatti, introgressioni multiple di S. pennellii (approccio di piramidalizzazione di QTL) inserite nel background genetico coltivato, hanno permesso di ottenere l’ibrido AB2, che attualmente è la varietà di pomodoro da industria leader in California.<7p>

Sviluppo e uso di popolazioni di mutanti

Nel pomodoro, sono inoltre disponibili numerose risorse per gli studi di genomica funzionale quali per esempio collezioni di mutanti di diversi genotipi. Presso il Tomato Genetics Resource Center (TGRC) dell’Università della California a Davis è disponibile un ampio catalogo di risorse genetiche tra cui più di 1000 accessioni di pomodoro di specie coltivate e selvatiche e migliaia di mutanti monogenici. Inoltre il catalogo Genes that Make Tomatoes, che include 13.000 mutanti (popolazione M2), provenienti da mutagenesi chimica e fisica di semi del genotipo M82, è disponibile e accessibile mediante il sito SGN. Entrambi i cataloghi consentono un accesso rapido alle caratteristiche morfologiche e fisiologiche dei mutanti e prevedono la possibilità di ordinare i genotipi di interesse. Due nuove collezioni di mutanti sono state recentemente sviluppate nella cultivar Microtom, che per le piccole dimensioni e per il rapido ciclo vitale è particolarmente utile per analisi su larga scala e si sta imponendo come genotipo modello del pomodoro. Queste ultime collezioni sono disponibili presso il National Institute of Genetics in Giappone e le caratteristiche fenotipiche di mutanti sono consultabili nel database pilota TOMATOMA (Tomato Mutant Archives). Recenti iniziative internazionali hanno permesso lo sviluppo di ulteriori risorse per studi avanzati di genomica funzionale quali differenti popolazioni di mutanti inserzionali (T-DNA) e 2 popolazioni ottenute mediante tecnologia TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). Questa ultima tecnologia, applicata sia nel settore animale sia in quello vegetale e sviluppata recentemente in pomodoro da gruppi di ricerca italiani, si basa su un sistema di genetica inversa che associa alla mutagenesi chimica tradizionale tecniche avanzate di biologia molecolare per individuare la/e mutazione/i puntiforme/i e quindi l’allelle o la serie allelica del gene responsabile di caratteri di interesse. È atteso che esperimenti su larga scala che possano utilizzare sistemi robotici di fenotipizzazione potranno generare in breve tempo indicazioni su un numero considerevole di mutazioni favorevoli e geni coinvolti e quindi di nuovi genotipi di interesse da introdurre rapidamente in programmi di miglioramento genetico del pomodoro.

Sviluppo di piattaforme per l’analisi trascrittomica, proteomica, metabolomica

L’ampiezza e la completezza delle collezioni EST disponibili per il pomodoro ha permesso già dal 2000 di realizzare diversi strumenti per analisi del trascrittoma, costruiti utilizzando prodotti di PCR amplificati come EST o frammenti di geni candidati di cui si desidera monitorare il livello d’espressione (microarray a cDNA) oppure impiegando oligonucleotidi (oligo-array) sintetizzati direttamente sui chip. Sono oggi quindi disponibili per la comunità scientifica diversi tipi di piattaforme per l’analisi trascrizionale aggiornate con i più recenti dati di sequenza alle quali si stanno aggiungendo quelle che utilizzano tecnologie ad altissima produttività basate su approcci di sequenziamento di nuova generazione (RNAseq). Tutti gli approcci di analisi di espressione prevedono l’uso di strumenti bioinformatici e statistici molto avanzati e il concomitante sviluppo di banche dati di espressione genica dedicate al confronto dei dati di diversi esperimenti e all’integrazione di dati di piattaforme differenti al fine di associare il livello di espressione di geni e network in una determinata situazione sperimentale/ stadio di sviluppo/ tessuto a un fenotipo d’interesse e quindi di individuare geni coinvolti nel controllo dei caratteri oggetto di studio. Negli ultimi anni approcci di analisi globale del trascrittoma di pomodoro hanno quindi permesso di identificare geni chiave coinvolti nello sviluppo e nella maturazione del frutto e nella determinazione della sua qualità organolettica e nutrizionale nonché geni coinvolti nella risposta a stimoli biotici e abiotici ed, in particolare, set genici la cui espressione è putativamente correlata con la capacità di tollerare alte temperature. Associati agli studi di tipo genomico, grazie allo sviluppo di protocolli sperimentali e approcci bioinformatici ad alta produttività, recentemente anche in pomodoro si sono affermati studi globali sulla componente proteica e metabolica. Anche se specifiche criticità ancora esistono sia dal punto di vista tecnico-procedurale sia da quello di integrazione delle diverse piattaforme, l’interesse dell’applicazione integrata delle tecnologie -omiche nel pomodoro è al momento focalizzato sulla maturazione del frutto. In tale sistema l’analisi dei geni espressi è correlata al corredo proteomico del frutto in maturazione e al profilo dei principali metaboliti e della componente volatile, fattore cruciale dell’aroma globale del frutto. Tali approcci hanno già messo in evidenza fondamentali differenze molecolari tra i diversi tipi di pomodoro, che caratterizzano le produzioni agricole italiane (tipo Allungato, Vesuviano, Sorrento, Corbarino), che spiegano le loro peculiari e distintive proprietà organolettiche e nutrizionali. Dal punto di vista applicativo le conoscenze acquisite permetteranno lo sviluppo di strumenti di grande efficacia non solo per la selezione di nuovi tipi con caratteristiche del frutto migliorate ma anche per la salvaguardia della tipicità dei prodotti locali, la tracciabilità dei prodotti sia freschi sia trasformati e la sicurezza alimentare.

Prospettive

I diversi approcci genomici sopra descritti richiedono un enorme sforzo di integrazione per la comprensione dal punto di vista biologico di grandi moli di dati e lo sviluppo di modelli di predizione. Infatti, dopo il raggiungimento dell’obiettivo del sequenziamento dell’intero genoma, è nel settore della bioinformatica e biostatistica che si sono recentemente focalizzati gli sforzi della comunità scientifica del pomodoro e delle Solanaceae con lo sviluppo di piattaforme di analisi per la catalogazione, l’integrazione e la gestione di dati di genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica. Sono in corso di allestimento quindi piattaforme integrate multilivello, a cui l’Italia sta contribuendo con la piattaforma ISOLa, per lo sviluppo di modelli tipici della biologia dei sistemi. Per i genetisti è importante che tali piattaforme siano integrate, inoltre, ai dati di fenotipizzazione per descrivere adeguatamente le relazioni fenotipo-genotipo ed evidenziare l’associazione tra le caratteristiche di interesse e i processi molecolari che le determinano.


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