Volume: la patata

Sezione: ricerca

Capitolo: specie selvatiche di patata e nuove tecnologie genomiche

Autori: Jim Bradeen, Riccardo Aversano

Germoplasma selvatico del genere Solanum

Ai numerosi primati mondiali della patata coltivata in termini di produzione, superficie investita, versatilità produttiva e proprietà nutrizionali, va aggiunto certamente il vantaggio di avere il più ampio e ricco germoplasma selvatico del regno vegetale. Esso conta più di 200 specie selvatiche la cui distribuzione ecogeografica si estende dal sud-ovest degli Stati Uniti fino all’Argentina e all’adiacente Cile, coprendo un’ampia ed eterogenea fascia climatica di oltre 70 paralleli. La straordinaria variabilità di habitat in cui si possono trovare queste specie, da una latitudine di 60° N a 50° S (dal deserto alle foreste tropicali) e da un’altitudine che si innalza dal livello del mare fino a 4000 m, è indice di una grande plasticità genetica per l’adattamento agli stress ambientali e per la resistenza a una grande quantità di malattie e parassiti. Per tutelare tale biodiversità sono state condotte numerose spedizioni di raccolta di germoplasma. La prima, compiuta grazie all’opera pioneristica dello scienziato russo Vavilon, risale al 1925, mentre le più recenti risalgono agli anni Novanta.

Ploidia

Sebbene la maggior parte delle specie selvatiche di patata sia diploide (2n=2x=24), molte di esse sono poliploidi con un livello di ploidia che può variare dal triploide (2n=3x=36) all’esaploide (2n=6x=72). Alcune specie selvatiche, inoltre, hanno livelli di ploidia diversi anche se morfologicamente indistinguibili; ciò è legato alla presenza di diversi citotipi nell’ambito della stessa specie. Alcuni esempi sono Solanum maglia (diploide e triploide), S. oplocense (tetraploide ed esaploide) e S. gourlayi (diploide e tetraploide). Le specie diploidi sono generalmente autoincompatibili, mentre le specie poliploidi (tetraploidi ed esaploidi) si autofecondano, pur con perdita di vigore (depressione da inbreeding) dopo alcune generazioni.

Utilizzazione delle specie selvatiche di patata

L’attenzione dei miglioratori oggi è rivolta alla costituzione di varietà superiori, rispondenti alle moderne esigenze di un’agricoltura più sostenibile e rispettosa dell’ambiente. I progenitori selvatici della patata, in tal senso, rappresentano un serbatoio importantissimo di variabilità in cui reperire tutti i caratteri necessari alla costituzione di una varietà. Questo è il caso delle numerose specie selvatiche della superserie Stellata, le quali presentano resistenze a stress biotici e abiotici di notevole importanza. S. chacoense, per esempio, nelle sue diverse accessioni risulta resistente alla maggior parte delle malattie virali che colpiscono la patata (PVX, PVA, PVF, e PLRV) e alla gamba nera. Fonti di resistenze alla Leptinotarsa decemlineata, al Myzus persicae, alla Phtorimaea operculella, alla Phytophthora infestans e al Verticillium sono state riportate in S. berthaultii. La resistenza a Verticillium spp. e Clavibacter spp. è stata riportata in S. lesteri, S. polyadenium e S. jamesii. Tra le altre specie dotate di resistenze multiple vi sono: S. bulbocastanum, S. commersonii, S. palustre, S. sparsifolium, S. sparsipilum, S. stolomiferum, S. tarijense. Dalle specie selvatiche sono derivate le resistenze presenti nelle varietà di patata attualmente coltivate. In particolare, la resistenza alla peronospora della patata fu introdotta nelle varietà coltivate da S. demissum e S. stoloniferum; a quest’ultime, unitamente a S. chacoense e S. acaule, si deve anche la resistenza ai virus di molte cultivar; infine, la resistenza ai nematodi cisticoli fu introdotta da S. vernei e S. spegazzinii. Incredibilmente, alla fine degli anni Ottanta queste sei specie selvatiche, assieme a S. tuberosum subsp. andigena e S. phureja, erano le uniche a essere state utilizzate nel miglioramento genetico di varietà europee. Il lavoro di miglioramento genetico che prevede l’uso delle specie selvatiche richiede tempi molto lunghi, in quanto i caratteri positivi di resistenza sono spesso associati a scarsa produzione e qualità dei tuberi. Inoltre, la presenza di meccanismi di isolamento sessuale spesso impedisce il trasferimento dei caratteri d’interesse da alcune specie selvatiche alla patata coltivata; ciò ne limita enormemente l’utilizzo nei programmi di miglioramento genetico. Tra i molti ricercatori cha hanno dedicato la loro vita alla messa a punto di strategie di utilizzazione del germoplasma selvatico di patata, Stanley J. Peloquin è stato certamente il più grande tra i genetisti. Gli approcci da lui adottati per il superamento delle incompatibilità tra specie sessualmente isolate di Solanum sono ancora oggi adottate. Al lavoro di Peloquin si aggiunge quello realizzato da Johnson e collaboratori Per cercare di spiegare l’esito positivo o negativo dell’incrocio tra due genotipi di patata appartenenti a specie diverse o aventi livelli di ploidia differenti, nel 1980 Johnston introdusse il concetto di Endosperm Balance Number (EBN).

Ipotesi dell’Endosperm Balance Number (EBN)

Nella patata, così come in molte altre angiosperme, l’aborto dell’endosperma è considerato la causa primaria del fallimento del seme in seguito a incroci interspecifici. Per spiegare i meccanismi alla base di tale incompatibilità, Johnston e collaboratori (1980) condussero alcuni esperimenti con specie del genere Solanum ed elaborarono il modello dell’EBN. In questo modello, ogni specie ha un numero effettivo (l’EBN), che non necessariamente riflette direttamente la sua ploidia. L’EBN è un numero assegnato empiricamente a una specie in base all’esito di incroci interspecifici con specie tester a EBN preassegnato. Negli esperimenti di Johnston e coll. la specie diploide (2n=2x=24) S. chacoense fu scelta come specie tester e ad essa fu assegnato un valore arbitrario di EBN=2 (2EBN). Analogamente, agli individui tetraploidi (2n=4x=48) di S. chacoense, ottenuti mediante raddoppiamento cromosomico, fu assegnato un EBN=4 (4EBN). Johnston e collaboratori classificarono così le specie di Solanum in diversi gruppi sulla base della loro compatibilità d’incrocio con il diploide (2EBN) e il tetraploide (4EBN) di S. chacoense e da queste informazioni predissero l’EBN di ciascun gruppo. Sulla base dei risultati ottenuti formularono l’ipotesi dell’EBN, secondo la quale affinché un incrocio abbia successo è necessario che il rapporto tra EBN materno e paterno nell’endosperma ibrido sia di 2:1. Ciò si verifica quando i due parentali hanno lo stesso valore di EBN. Deviazioni dal rapporto 2:1 conducono a una degenerazione dell’endosperma e conseguentemente all’aborto dell’embrione. Per verificare le basi genetiche del modello, Ehlenfeldt e Hanneman incrociarono le specie diploidi S. cardiophyllum, S. brevidens e S. commersonii (riproduttivamente isolate da altre specie diploidi) con la specie tester S. chacoense (2EBN). S. brevidens, per esempio, diede progenie fertile solo dopo tetraploidizzazione mediante colchicina. Pertanto a S. brevidens fu assegnato un valore di EBN=1, così come a S. cardiophyllum e S. commersonii. Altri autori hanno confermato il modello EBN e così sono state classificate molte specie di Solanum. Alla patata coltivata è stato assegnato un valore di 4EBN. Alle specie diploidi sono stati assegnati valori sia 1EBN (per es., quelle appartenenti alle serie Etuberosa e Commersoniana), sia 2EBN (per es., tutte le specie diploidi coltivate e la maggior parte delle specie selvatiche, come S. multidissectum e S. verrucosum). Alle specie tetraploidi sono stati assegnati valori sia 2EBN sia 4EBN. A tutte le specie esaploidi, come S. demissum e S. oplocense, è stato assegnato il valore 4EBN. Il ruolo essenziale svolto dall’EBN nei meccanismi di isolamento delle specie di Solanum ha contributo enormemente alla loro evoluzione. L’EBN, infatti, fungendo da barriera riproduttiva tra specie simpatriche, rappresenta un meccanismo stabilizzante dei genomi. Per questa ragione, per esempio, la specie diploide S. commersonii (1EBN) non può essere incrociata con la specie S. chacoense, anch’essa diploide, ma 2EBN. D’altra parte, S. commersonii è sessualmente compatibile con le specie diploidi 1EBN. In merito agli incroci inter-EBN, essi sono sporadici e riconducibili probabilmente a eventi casuali non ereditabili, come l’impollinazione multipla delle cellule centrali, le anormalità mitotiche nei gametofiti, l’endomitosi del nucleo polare nell’endosperma o l’accrescimento del numero dei nuclei polari. Molti studi genetici in Solanum e Datura hanno evidenziato come l’EBN sia sotto il controllo di più geni a effetto additivo, localizzati su cromosomi differenti e con alleli in omozigosi. Come è stato già detto, le moderne varietà di patata sono state costituite principalmente attraverso l’applicazione dei principi della genetica mendeliana e dei metodi di miglioramento genetico convenzionali. Tuttavia, le esigenze della moderna agricoltura sono cambiate nel corso dell’ultimo trentennio. Il nuovo compito del miglioramento genetico è quello di generare tecnologie moderne volte a produrre varietà di piante ecocompatibili, in altre parole adatte alle caratteristiche dei diversi ecosistemi, in armonia con l’ambiente e perciò più idonee a limitare il degrado delle risorse naturali: acqua, suolo, biodiversità, clima. Così è nata la genomica, la scienza che integra citologia, genetica classica, quantitativa, di popolazione e molecolare con nuove tecnologie derivanti dall’informatica e dalle possibilità offerte dall’introduzione di sistemi automatizzati e robotizzati. I risultati prodotti negli studi di genomica forniscono gli strumenti per aumentare l’efficienza dei metodi convenzionali del miglioramento genetico classico e per utilizzare appieno l’enorme patrimonio di specie selvatiche della patata.

Genomica e studi sulla patata

Com’è avvenuto per molte importanti piante di interesse agrario, la genomica sta rivoluzionando la ricerca biologica sulla patata. Il termine “genoma” si riferisce collettivamente a tutte le sequenze geniche e non codificanti di un organismo, mentre il termine “genomica” indica un approccio globale allo studio del genoma nel suo insieme. La genomica può essere considerata una branca della genetica sviluppatasi grazie ai progressi tecnologici e alle accresciute capacità analitiche degli ultimi decenni. In questo paragrafo discuteremo due principali suddivisioni nel campo della genomica: la genomica strutturale e la genomica funzionale. Ognuna di esse è stata ampiamente utilizzata nello studio della patata.

Genomica strutturale

La genomica strutturale si occupa dell’organizzazione fisica del genoma, compresi l’aspetto dei cromosomi (il cariotipo) e la distribuzione dei geni e degli elementi non codificanti su di essi. Tra gli strumenti molecolari che consentono l’indagine dei genomi e lo studio della loro organizzazione, i marcatori molecolari sono, certamente, i più efficaci e adoperati. L’uso dei marcatori nella genetica vegetale è iniziato negli anni Settanta, quando il metodo per la caratterizzazione e la differenziazione genetica degli individui si basava sull’analisi delle forme alternative delle proteine (gli isoenzimi). In seguito, i ricercatori hanno iniziato ad analizzare direttamente le differenze (polimorfismi) nella sequenza nucleotidica del DNA, sviluppando così i primi marcatori molecolari come gli RFLP (acronimo di Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione), messi a punto impiegando enzimi di restrizione in combinazione con tecniche di ibridazioni del DNA. Più recentemente sono stati sviluppati i marcatori PCR-derivati. I RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, DNA polimorfico amplificato a caso) sono stati tra i primi marcatori molecolari basati sull’amplificazione PCR di sequenze casuali di DNA; successivamente gli AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, polimorfismo della lunghezza dei frammenti – di restrizione – amplificati), gli SSR (Single Sequence Repeat, sequenze ripetute semplici) e gli STS (Sequence-Tagged Sites, siti con sequenza etichettata) hanno migliorato la qualità della ricerca genetica grazie all’elevato numero di polimorfismi rilevati. Altri marcatori basati sulla PCR possono essere derivati da una delle classi elencate in precedenza. Esempi di marcatori derivati dalla PCR sono i CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, sequenze polimorfiche amplificate e ristrette) e gli SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions, regioni amplificate di sequenze caratterizzate). In tempi molto recenti sono state ideate metodiche veloci ed economiche per lo sviluppo di marcatori in grado di evidenziare con eccezionale efficienza il polimorfismo genetico tra gli individui. Tra questi marcatori i DArT (Diversity Arrays Technology) e gli SNP (Single-Nucleotide Polymorphism, polimorfismo di singoli nucleotidi) si stanno diffondendo sempre di più nella ricerca sulla patata. Per costruire una mappa di linkage occorre analizzare una popolazione di cinquanta o più individui figli. Successivamente, si esamina la presenza di specifici marcatori molecolari nel genoma di ciascun ibrido e per ogni marcatore si stabilisce se la pianta figlia è simile al genitore paterno o materno. Due marcatori sono detti “associati” (linked) se co-segregano nella progenie più spesso di quanto atteso su base casuale. Due marcatori che segregano sempre insieme nella progenie (per es., ogni pianta figlia ha entrambi i marcatori derivanti dalla madre o entrambi i marcatori derivanti dal padre) sono “perfettamente associati”. I marcatori, occasionalmente, possono non co-segregare (per es., uno dei marcatori in una determinata pianta figlia proviene dalla madre e l’altro dal padre). Sebbene questi marcatori possano dirsi ancora associati, essi non lo sono in modo perfetto e la frequenza con la quale si separano nella progenie è una misura della loro distanza genetica. Infine, i marcatori possono segregare in modo casuale nella progenie secondo rapporti prevedibili. Quando accade ciò, significa che i marcatori non sono associati e sono localizzati su cromosomi differenti o in regioni distanti dello stesso cromosoma. Una mappa di linkage è una rappresentazione grafica delle distanze genetiche tra marcatori molecolari, calcolate in maniera statistica. In pratica, i ricercatori ricorrono a banche dati o a registri di annotazione su cui appuntano i dati di segregazione di ciascun marcatore nella progenie ibrida; poi, mediante software ad hoc (MapMaker e Joinmap sono i più diffusi), calcolano le distanze genetiche e sviluppano le mappe. I moderni tentativi di mappatura dei gruppi di linkage nella patata hanno portato alla creazione di mappe ad alta densità (con una più di 10.000 marcatori AFLP) per la specie coltivata e più piccole per alcune specie selvatiche. Dall’analisi delle mappe di linkage è possibile stabilire la localizzazione dei geni. Monitorando un carattere di interesse (per es., forma del tubero, resa o resistenza alle malattie) negli individui di una progenie e studiando le correlazione (co-segregazione) tra i marcatori molecolari e i caratteri, i ricercatori riescono a stabilire se e in che misura i primi sono associati ai secondi. I marcatori molecolari, infatti, possono essere associati in modo perfetto, associati oppure non associati al gene che controlla il carattere in esame, e le distanze genetiche tra il gene e il marcatore possono essere calcolate. Grazie alla determinazione di tali distanze genetiche, i geni possono essere posizionati sulle mappe di linkage. Finora, sono molti i geni di resistenza alle principali malattie della patata a essere stati mappati sia nella specie coltivata che in specie correlate. La mappatura di singoli geni è un’operazione piuttosto facile; più difficoltosa è, invece, la mappatura di loci di caratteri quantitativi (QTL, Quantitative Trait Loci), cioè poligeni che influenzano caratteri complessi, come la resa produttiva (misurata in kg/pianta). Le tecniche di mappatura tramite ricombinazione sono applicabili anche nel caso dei QTL, ma le analisi risultanti sono molto più complesse ed è necessario ricorrere ad analisi statistiche. Nonostante queste difficoltà, molti QTL sono stati mappati in patata, per esempio quelli che controllano i caratteri di maturità, resistenza quantitativa alle malattie e qualità del tubero.

Mappatura fisica

Mentre i linkage e le mappe genetiche sono sviluppati sulla base delle distanze genetiche e delle frequenze di ricombinazione tra i marcatori, una mappa fisica si basa sul numero reale o stimato di nucleotidi presenti tra due marcatori. Uno degli scopi di questa procedura è identificare un insieme di frammenti clonati che si sovrappongono e che nel loro insieme rappresentano un intero cromosoma, o addirittura l’intero genoma. Per costruire una mappa fisica occorre partire da un gran numero di cloni, derivanti dal campione originale di DNA da mappare, clonati in vettori di dimensioni molto grandi, come gli YAC (Yeast Artificial Chromosome, cromosomi artificiali di lievito) o i BAC (Bacterial Artificial Chromosome, cromosomi artificiali di batteri). Ogni colonia di batteri o lieviti contiene un frammento unico di DNA di patata cosicché l’intero genoma è rappresentato da una serie di colonie (generalmente migliaia). Individualmente, queste colonie sono denominate “cloni”, collettivamente “libreria”. Le mappe fisiche possono coprire l’intero genoma di patata o una particolare regione (per es., una regione cromosomica contenente un gene di resistenza).

Mappatura fisica dell’intero genoma. Le mappe fisiche dell’intero genoma sono state ottenute per la patata coltivata e per la specie selvatica Solanum bulbocastanum. Differenti protocolli e approcci sono stati seguiti per le due specie, ma in entrambi i casi l’assemblaggio della mappa è avvenuto tramite l’allineamento di cloni isolati a caso da ampie librerie di inserti. Il metodo più efficace per ricostruire l’ordine dei cloni è di confrontarli tra loro e allinearli in base ai profili ottenuti in seguito a digestione enzimatica. Confrontando tra loro i profili di restrizione è possibile, infatti, allineare i cloni in base alle regioni di sovrapposizione e assemblare così intere regioni cromosomiche in cui i singoli cloni sono ordinati su tutta la loro lunghezza. Le mappe fisiche, inoltre, forniscono l’impalcatura per l’ancoraggio di marcatori molecolari mappati mediante analisi genetiche. Le risultanti “mappe integrate” sono un formidabile strumento per il sequenziamento dei genomi vegetali.

Mappatura fisica di regioni specifiche. Più comune della mappatura fisica di tutto il genoma è la creazione di mappe fisiche di regioni specifiche del genoma di patata. Tentativi in questa direzione sono stati condotti soprattutto da ricercatori interessati all’isolamento di geni singoli applicando la metodologia del chromosome walking (letteralmente “passeggiata sul cromosoma”). Lo sviluppo di mappe fisiche per regioni specifiche avviene spesso in associazione alla mappatura genetica di precisione mediante marcatori molecolari. Assumendo che i marcatori molecolari mappati fiancheggino il gene di interesse, lo sviluppo di una mappa fisica che incorpora marcatori a monte e a valle del gene d’interesse assicura che questo possa essere ritrovato all’interno di uno degli inserti di cui è costituita la regione. Anche se laborioso e talvolta tedioso, lo sviluppo di mappe fisiche di regioni specifiche ha avuto un grande successo nello studio dei geni di patata. L’isolamento del gene RB che conferisce resistenza alla peronospora della patata è un tipico esempio.

Sequenziamento del genoma

Le tecnologie di sequenziamento del DNA hanno avuto un nuovo impulso nell’ultimo decennio. I metodi “tradizionali” di sequenziamento, basati sul sistema di interruzione della catena nucleotidica inventato da Frederick Sanger, hanno permesso di ottenere sequenze di DNA di elevata qualità e sono state utilizzate esclusivamente nello sviluppo delle prime sequenze genomiche di piante quali Arabidopsis thaliana (pianta modello per gli studi di genetica vegetale) e riso (Oryza sativa subsp. indica e subsp japonica). Questi metodi sono stati usati anche per generare la prima sequenza del genoma umano. Sfortunatamente, il metodo Sanger richiede uno sforzo rilevante nella preparazione dello stampo di DNA (ovvero nella preparazione delle librerie di inserti) e può essere piuttosto costoso se usato su larga scala: la generazione di sequenze di genoma da Arabidopsis, riso ed esseri umani è costata in tutti questi casi diversi milioni di euro. Negli ultimi cinque anni, le cosiddette tecnologie di sequenziamento di seconda generazione (NGS, Next Generation Sequencing) sono divenute facilmente accessibili ai ricercatori di tutto il mondo. Queste non richiedono un’eccessiva preparazione del campione e, cosa ancora più importante, sono rapide e poco costose, fornendo, a un costo esiguo, un numero di informazioni di sequenza maggiore di tre ordini di grandezza rispetto a quello ottenibile con il metodo Sanger. Le tecnologie di seconda generazione comprendono per lo più metodi di “sequenziamento per sintesi” in cui frammenti di DNA (per es., un frammento di genoma di patata) sono amplificati enzimaticamente mediante incorporazione graduale di nucleotidi. L’accrescimento della catena di DNA di neosintesi è accompagnato dall’emissione di luce, rilevata da una camera dotata di un dispositivo a carica elettrica accoppiata (CCD, Charge-Coupled Device) in grado di registrare e visualizzare la luce prodotta come picco in un pirogramma. Algoritmi computerizzati sono di solito utilizzati per decifrare le sequenze di DNA sulla base del tempo e dell’intensità delle emissioni. In generale, tra le tecnologie di sequenziamento per sintesi vi è un bilanciamento tra lunghezza e accuratezza delle sequenze di DNA prodotte. Tuttavia, l’elevata efficienza delle tecnologie di seconda generazione consente il risequenziamento dei singoli frammenti di DNA. Gli errori, in tal modo, possono essere corretti facendo una media di letture multiple dello stesso frammento, con una rilevante riduzione della loro frequenza. In pratica, la frequenza di errore delle tecnologie di seconda generazione è paragonabile a quella del metodo Sanger, anche se le prime forniscono una mole di dati molto maggiore e a costi sensibilmente inferiori. Le tecnologie di terza generazione che stanno per essere introdotte permetteranno il sequenziamento di singoli filamenti di DNA senza l’amplificazione enzimatica. Tali approcci presenteranno il vantaggio di avere un’elevata processività e di generare sequenze di DNA molto lunghe (fino a 50 kb in certe condizioni). Con il miglioramento delle tecnologie di sequenziamento del DNA, cresce nell’ambito della comunità scientifica mondiale la necessità di un supporto bioinformatico efficiente. L’obiettivo del “genoma da 1000 dollari” sarà presto realizzato e la nostra capacità di immagazzinare e interpretare i dati della sequenza di DNA va certamente migliorata. Occorre, quindi, sviluppare nuovi algoritmi per assemblare velocemente brevi sequenze di DNA e nuovi software per la consultazioni di enormi banche dati. Anche per la patata, la recente rivoluzione delle tecnologie genomiche ha portato a un cambiamento delle strategia di sequenziamento del genoma. Oggi la sequenza di gran parte del genoma di patata è disponibile in banche dati pubbliche, ma già sono in corso tentativi internazionali volti al miglioramento dei risultati ottenuti. Analogamente, anche il genoma del pomodoro, parente stretto della patata, è in corso di sequenziamento. Come per il sequenziamento della patata, anche per questa specie sono state utilizzate sia la tecnologia Sanger sia le tecnologie di seconda generazione. Data la stretta relazione evolutiva tra le due specie, è probabile che la sequenza del genoma del pomodoro sia utile per la ricerca sulla patata, consentendo la previsione della posizione e della struttura dei geni. Infine, un gruppo di ricercatori di diverse nazioni, denominato Sol100, si è impegnato a sequenziare nei prossimi anni il genoma di 100 specie di Solanaceae, compresi i genitori selvatici della patata coltivata. Tutte queste informazioni contribuiranno a chiarire molti aspetti della biologia della patata, accelerandone così il miglioramento genetico.

Genomica funzionale

La genomica funzionale si occupa della comprensione della regolazione dei geni e del modo in cui geni, proteine e metaboliti determinano i caratteri. In tal senso, la genomica funzionale offre un aiuto concreto al miglioramento genetico delle piante agrarie. In questo paragrafo, prenderemo in esame i recenti risultati derivanti dall’analisi del trascrittoma (l’insieme completo dei trascritti prodotti da un dato organismo) e del proteoma (l’intera gamma delle proteine codificate dal genoma) della patata e dai tentativi di migliorarla mediante le tecnologie del DNA ricombinante.

Trascrittomica

Il dogma centrale della genetica afferma che il DNA, una volta trascritto in RNA, è tradotto in proteine. Pertanto, il DNA (sotto forma di geni) funge da progetto esecutivo (blueprint) e l’RNA da lista di istruzioni copiata dal progetto, mentre le proteine, considerate i mattoni dell’organismo, sono il prodotto finale. Nel tentativo di comprendere in che modo i fenotipi delle piante sono determinati e controllati, i ricercatori hanno focalizzato la loro attenzione su due fasi regolatrici chiave del dogma centrale: la trascrizione del DNA in RNA e la traduzione dell’RNA in proteine. Il termine “trascritto” è usato per descrivere una specifica molecola di RNA copiata da un gene specifico. Il termine “trascrittoma” si riferisce all’intero corredo di trascritti espressi in una particolare cellula o tessuto di un organismo, in determinati momenti dello sviluppo o in determinate condizioni ambientali. In tal senso, la “trascrittomica” può essere considerata la branca della genomica che studia il trascrittoma. È importante sottolineare che mentre il genoma resta invariato nell’arco della vita dell’organismo, il trascrittoma varia continuamente in risposta a stimoli (fisiologici, ambientali e di accrescimento). Per esempio, un gene di risposta allo stress da siccità può essere attivato in condizioni di carenza idrica e a livelli variabili (poco o molto). In altre parole, i cambiamenti ambientali possono causare l’attivazione dei geni della pianta e tale attivazione può essere modulata in proporzione all’entità dei cambiamenti stessi (con conseguente produzione di molto o poco RNA). A sua volta, l’RNA può essere tradotto in proteine. In generale, poco RNA consente di formare poche proteine e, viceversa, molto RNA determina la sintesi di molte proteine. Ogni pianta possiede diverse migliaia di geni e ciascun gene è costantemente regolato in risposta agli stimoli. La trascrizione e la traduzione dei geni sono eventi che richiedono energia e le interazioni tra prodotti genici devono essere accuratamente controllate. Per questi motivi, le piante hanno sviluppato nel corso della loro storia evolutiva meccanismi regolatori molto sensibili e sofisticati. Il compito dei ricercatori è monitorare i livelli di trascrizione delle piante in risposta agli stimoli (per es., siccità, attacchi di patogeni o trattamento con fertilizzanti) per migliorare la comprensione di quanto fanno i geni, di come funzionano le piante e di come migliorarne la performance in termini di raccolto. Il metodo più diffuso per ottenere dati quantitativi sull’espressione di geni singoli è la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR), mentre i microarray rappresentano la tecnologia più diffusa per realizzare studi di espressione di molti geni in parallelo. Le metodologie di sequenziamento del DNA sono state adattate anche allo studio del trascrittoma per mezzo dei segnali di sequenze espresse (EST, Expressed Sequence Tag) o approcci comprendenti il sequenziamento dell’RNA (RNAseq). Tutti i metodi moderni di trascrittomica determinano quali geni siano attivati e il grado in cui lo sono confrontando i livelli di espressione dei geni del gruppo sperimentale con quelli del gruppo di controllo.

Proteomica

Le piante regolano in modo molto efficiente la trascrizione dei geni in RNA. Allo stesso modo, la traduzione dell’RNA in proteine è rigorosamente controllata. Il termine “proteoma” è utilizzato per descrivere l’intero set di proteine di una particolare cellula o tessuto di un organismo, in determinati momenti dello sviluppo o in particolari condizioni ambientali. In tal senso, la “proteomica” può essere considerata la branca della genomica che studia il proteoma. Come il trascrittoma, il proteoma cambia in continuazione in risposta a stimoli fisiologici, ambientali ecc. A causa della possibilità di modifiche post-traduzionali, il proteoma può consistere di centinaia di migliaia di differenti tipi di proteine, sebbene il genoma comprenda solo decine di migliaia di geni. La complessità del proteoma e la difficoltà delle tecniche analitiche associate hanno limitato la nostra comprensione del patrimonio proteico della patata. Tuttavia, molti laboratori in tutto il mondo stanno contribuendo significativamente allo studio della struttura e dell’espressione delle proteine e nel prossimo futuro, probabilmente, la ricerca in questo ambito subirà un’importante crescita. Finora, le ricerche condotte in questo campo hanno riguardato principalmente il tubero della patata e in particolare lo studio dei componenti della buccia, dei fenomeni correlati alle diverse fasi di sviluppo e la determinazione delle principali classi proteiche.

Trasformazione

Per i molti ricercatori che si occupano della patata, il miglioramento delle resistenze e delle produzioni rappresenta un obiettivo prioritario. Sebbene tutti i geni necessari per la realizzazione di tali obiettivi siano disponibili in varietà poco diffuse e in specie selvatiche, il loro trasferimento in varietà d’élite è estremamente difficile. La natura tetraploide della patata coltivata, infatti, impedisce il recupero dei caratteri d’interesse da uno specifico genotipo tramite incroci inter- (tra specie diverse di patata) e intraspecifici (tra varietà di patata). L’ingegneria genetica, negli ultimi decenni, ha reso possibile la manipolazione dei genomi e il trasferimento mirato di frammenti genici tra organismi. Grazie alle tecniche del DNA ricombinante, infatti, è possibile inserire un gene d’interesse in una varietà di patata, indipendentemente dalle incompatibilità sessuali esistenti, conservando tutte le caratteristiche che la rendono un prodotto apprezzato dai coltivatori e dai consumatori. Le tecniche per il trasferimento di specifici geni nel genoma di patata sono numerose, ma la più diffusa è la trasformazione mediante il batterio Agrobacterium tumefaciens. Anche se le piante coltivate geneticamente modificate (OGM) faticano a essere accettate dai consumatori, il processo di trasformazione ha un’origine sorprendentemente naturale. Nella sua forma nativa, l’A. tumefaciens è un patogeno delle piante capace di infettare molte specie e di causare la malattia nota come “tumore batterico del colletto”. Questo batterio ha la proprietà di assumere il controllo del genoma delle cellule infettate grazie all’inserimento di una porzione del suo DNA nel genoma della pianta ospite. Il risultato è che la pianta, una volta trasformata, inizia a produrre una classe di molecole, le opine, mai prodotte prima dalla pianta e utili all’accrescimento del batterio. Pertanto, in senso letterale, l’Agrobacterium ha trasformato piante per milioni di anni! Grazie agli sforzi condotti dalla comunità scientifica internazionale nei decenni scorsi, i geni attivati dall’A. tumefaciens durante il processo di trasformazione sono stati isolati e il suo genoma manipolato al fine di sostituire i geni per la sintesi delle opine con i geni d’interesse. Nella patata, per esempio, i geni delle opine sono stati sostituiti da un gene che conferisce resistenza alla peronospora. L’A. tumefaciens così “ingegnerizzato” ha la proprietà di inserire nel genoma della pianta ospite il gene per la resistenza alla peronospora anziché i geni responsabili della sintesi delle opine. Poiché molti geni destinati al miglioramento della patata sono derivati dalle specie selvatiche, l’uso delle moderne tecniche di trasformazione porterà a piante di patata portatrici di geni derivati solo da altre piante di patata. Per descrivere questo processo è stato coniato il termine cisgenesi, con cui si è soliti indicare ai coltivatori e ai consumatori che nel genoma della pianta ospite (per es., la patata) non sono stati incorporati geni di provenienza non vegetale. Molti progressi sono stati compiuti nell’ambito del miglioramento genetico per le resistenze nella patata mediante le tecnologie appena descritte. Il terzo maggiore produttore di patate al mondo è l’India, un Paese altamente popolato che ogni anno deve fronteggiare l’instabilità di produzione a causa dei ricorrenti attacchi di peronospora che flagellano le coltivazioni. Piante di patata contenenti il gene di resistenza alla peronospora RB sono state sperimentate sul campo e si ritiene che saranno commercializzate in India nei prossimi due anni. Gli sforzi per trasformare la patata hanno anche portato a varietà con una composizione di amidi utile per alcuni alimenti, nonché per numerose applicazioni industriali. Attualmente, lo scetticismo dei consumatori e dei produttori verso le patate OGM ne limita l’uso sia in Europa sia negli Stati Uniti. Tuttavia, le tecnologie di trasformazione sono molto promettenti e si riveleranno utili non solo per introdurre le modifiche di produzione rese necessarie dai cambiamenti climatici globali, ma anche per ridurre la dipendenza dalla chimica nella produzione di patate.


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