Volume: la patata

Sezione: ricerca

Capitolo: miglioramento genetico

Autori: Domenico Carputo, Luigi Frusciante

Per una pataticoltura moderna ed ecosostenibile è fondamentale l’uso di varietà che a un ridotto consumo energetico associno il massimo rendimento e la migliore qualità del tubero. La costituzione di nuove varietà di patata con tali caratteristiche è un’attività di pertinenza del miglioramento genetico, inteso come arte e scienza finalizzate a modificare l’assetto genetico delle piante coltivate. Le recenti acquisizioni nel campo della genetica, delle biotecnologie, della fisiologia, della biologia molecolare e di numerose altre discipline hanno enormemente ampliato le possibilità del miglioramento genetico. Sono ormai molto diffusi approcci sperimentali ”ad alto rendimento” (high-throughput) che consentono l’analisi su vasta scala dei genomi e dei loro prodotti di espressione. Grazie alle conquiste della genetica molecolare e della genomica sono note la struttura, l’organizzazione e la funzione di molti geni, e a breve, quale risultato di uno sforzo scientifico internazionale, sarà disponibile l’intera sequenza del genoma della patata. Si può quindi affermare che le attività dei miglioratori si stanno sempre più indirizzando verso un miglioramento genetico ”di precisione” (precision breeding), che permetterà di ottenere il genotipo con alleli mirati per ogni specifico ambiente. In questo capitolo saranno prese in considerazione alcune delle più interessanti e diffuse strategie utilizzate nel miglioramento genetico della patata per produrre variabilità genetica e per effettuare una selezione efficiente. Affinché un miglioratore operi con successo è necessario che sappia integrare strategie convenzionali e innovative, coniugando le conoscenze della genetica vegetale con quelle delle altre discipline a essa collegate, nonché con le più recenti acquisizioni della genomica strutturale e funzionale.

Aspetti genetici rilevanti per il miglioramento genetico

Come discusso nel capitolo Risorse genetiche e genomica, la genetica della patata è davvero unica, e risulta più complicata di quella di ogni altra specie diploide o allopoliploide. Particolarmente importante per il miglioramento genetico è la situazione allelica a ciascun locus. Negli autopoliploidi, infatti, quanto più diversi sono gli alleli di uno stesso locus, tanto più elevata è l’eterozigosi, e maggiore è il numero di interazioni epistatiche e tra loci distinti. Dal punto di vista fenotipico ciò consente di massimizzare il vigore ibrido (eterosi). A ogni locus sono possibili fino a 4 alleli differenti (per esempio A1, A2, A3, A4) e quindi vari effetti genetici non-additivi: di primo ordine (tra due alleli), di secondo ordine (tra tre alleli) e di terzo ordine (tra tutti e quattro gli alleli). In un genotipo tetrallelico ciò corrisponde a 11 interazioni eteroalleliche. Il peggioramento delle performance delle progenie prodotte a seguito di autofecondazione o di incrocio tra parentali geneticamente simili è attribuibile non solo all’incremento di omozigosi, ma anche alla perdita di interazioni trialleliche e tetralleliche richieste per massimizzare l’eterosi. I miglioratori, pertanto, nel definire le strategie per massimizzare l’eterozigosi e il multiallelismo (e quindi l’eterosi) devono essere molto attenti all’uso di parentali appropriati. Progenie con alti livelli di multiallelismo possono essere prodotte attraverso impollinazioni controllate che coinvolgono parentali geneticamente diversi o sfruttando i gameti 2n. Occorre brevemente sottolineare altre caratteristiche genetiche importanti per il miglioramento genetico della patata. La prima è relativa al fatto che, come ogni specie propagata vegetativamente, la patata è altamente eterozigote. Di conseguenza, nella generazione F1 che segue l’ibridazione, è attesa la segregazione dei caratteri. La seconda è legata al fatto che genotipi omozigoti sono difficili da ottenere tramite autofecondazione a causa della depressione da inbreeding. L’ultima riguarda il fatto che la patata coltivata ha una base genetica ridotta rispetto alle specie selvatiche. Ciò è dovuto principalmente al numero limitato di genotipi che sono stati usati per sviluppare le tipologie coltivate. In tutti i programmi di miglioramento genetico occorre avere informazioni sulla base genetica dei caratteri da modificare. Nel caso di caratteri monogenici è importante conoscere il tipo di controllo genetico (dominante/recessivo), mentre nel caso di caratteri poligenici è fondamentale sapere il numero di loci coinvolti e l’ereditabilità del carattere. Questa è calcolata in base al rapporto tra la varianza genetica e la varianza totale attribuibile all’ambiente, ai geni e all’interazione genotipo-ambiente. È relativamente semplice migliorare i caratteri che hanno un controllo monogenico, in quanto le popolazioni segreganti sono raggruppabili in poche classi fenotipiche ben definite. Purtroppo, però, la maggior parte dei caratteri importanti per il miglioramento genetico della patata (per esempio produzione, resistenza a molti stress biotici e abiotici, contenuto in amido) ha un controllo poligenico e le popolazioni segreganti mostrano una variazione continua. I loci preposti al controllo di un carattere quantitativo sono denominati QTL (Quantitative Trait Loci, loci per i caratteri quantitativi) e possono avere effetti genici elevati (major QTL) o ridotti (minor QTL). Lo sviluppo degli strumenti della genomica consente di identificare, mappare e conoscere l’effetto dei QTL coinvolti nel controllo quantitativo di un carattere, e quindi di predisporre le strategie di miglioramento genetico più valide.

Obiettivi del miglioramento genetico

Dati i molteplici usi della patata (mercato fresco e industria di trasformazione in prodotti fritti, amido, appertizzati ecc.), gli obiettivi del miglioramento genetico sono numerosi e spesso contrastanti tra loro. Le priorità riguardano essenzialmente la qualità dei tuberi (colore della buccia, forma e calibro, contenuto in sostanza secca, resistenza all’addolcimento, caratteristiche dell’amido, contenuto in vitamine) e la resistenza a stress ambientali (siccità, alte e basse temperature, patogeni). Da rilevare che negli ultimi anni gli sforzi dei miglioratori tengono in grande considerazione non soltanto le esigenze legate alla sicurezza e alla qualità del tubero, ma anche alla protezione dell’ambiente e alla sostenibilità dell’agricoltura. La qualità è diventata un obiettivo importante ovunque. I fattori di qualità cambiano con le tipologie di utilizzazione e sono generalmente inclusi in due principali categorie. La prima è rappresentata dalla ”qualità esterna”, correlata a caratteri quali il colore della buccia, e la forma e la dimensione del tubero. Questi caratteri sono considerati molto importanti per il mercato fresco, in quanto i tuberi sono sottoposti al giudizio dei consumatori. La seconda categoria, la ”qualità interna”, include le proprietà nutrizionali e il valore culinario a seguito di cottura o trasformazione. Caratteri che influenzano la qualità interna sono il contenuto di sostanza secca, il sapore, il contenuto in zuccheri riduttori e proteine, la qualità dell’amido, il tipo e la quantità di antiossidanti presenti. In termini di resistenza a stress biotici, di primaria importanza è quella nei confronti di Phytophthora infestans, l’agente causale della peronospora della patata. Sin dalla sua prima catastrofica comparsa in Europa durante il XIX secolo, questo fungo è stato considerato il patogeno più temibile per questa coltura. In passato singoli geni di resistenza razza-specifici sono stati introgressi nelle varietà coltivate dalla specie selvatica esaploide S. demissum. Le nuove razze di P. infestans hanno ormai superato queste resistenze monogeniche, e c’è quindi necessità di nuove fonti di resistenza. Tra gli altri obiettivi del miglioramento genetico vi è anche la resistenza agli insetti Leptinotarsa decemlineata, Phtorimea operculella, Myzus spp. e Aphis spp., ai nematodi Globodera rostochiensis e G. pallida, e al batterio Streptomyces scabies. Negli ultimi anni il rinnovato interesse verso il mercato fresco e l’ingresso di nuovi Paesi nell’Unione Europea hanno spinto i miglioratori a considerare anche la resistenza a Colletotrichum coccodes, Clavibacter michiganensis, Ralstonia solanacearum e Dickeya dadantii (Erwinia chrysantemii). Tra gli stress abiotici, la resistenza alle alte temperature e agli stress idrici è ritenuta molto importante a causa della sempre maggiore diffusione della coltivazione di patata in aree con climi caldi. Vale la pena di segnalare anche la resistenza a basse temperature in ambienti dove la patata può essere coltivata tutto l’anno. Nell’area mediterranea, per esempio in Sicilia, i tuberi sono piantati a partire da novembre, in un ciclo che è più anticipato rispetto al tipico ciclo primaverile-estivo. A causa della mancanza di varietà resistenti, però, questa produzione extrastagionale, molto remunerativa, può essere seriamente compromessa dalle basse temperature.

Metodi convenzionali di miglioramento genetico

Il miglioramento genetico può usufruire di un insieme di procedure che rendono la patata una coltura modello per i miglioratori. Essa risponde bene a varie applicazioni delle colture in vitro, quali la fusione somatica e la coltura di antere e polline. Si è rivelata anche una specie ideale per la messa a punto di schemi di miglioramento basati sull’uso di gameti 2n e di protocolli di ingegneria genetica. In questo paragrafo saranno considerati i metodi di miglioramento genetico convenzionali basati sull’ibridazione sessuale. Essi saranno raggruppati in due livelli: il livello intraspecifico e il livello interspecifico. Livello intraspecifico. È essenzialmente basato su incroci tra genotipi (spesso varietà) 4x(4EBN) di S. tuberosum e sulla selezione fenotipica. Le varietà oggi usate derivano proprio da questo tipo di strategia, che non è molto diversa da quella realizzata nei primi programmi di miglioramento genetico della patata dell’inizio del Novecento. Il suo razionale è da sempre basato sulla valutazione di un numero decrescente di cloni tetraploidi selezionati con prove di campo e di laboratorio. La procedura inizia con l’identificazione di parentali 4x(4EBN) geneticamente diversi, aspetto cruciale per prevenire l’omozigosi e garantire un’elevata diversità allelica nella progenie. A causa degli alti livelli di eterozigosi, tipici della patata coltivata tetraploide, si produce una progenie F1 segregante. I tuberi raccolti da ciascun clone F1 selezionato costituiscono la prima generazione di selezione clonale. Essi sono utilizzati sia per allestire parcelle sperimentali sia per incrementare il numero di tuberi-seme necessari per le prove agronomiche successive. Nelle generazioni seguenti i cloni selezionati sono allevati in parcelle più grandi, e di volta in volta il loro numero, a seguito del lavoro di selezione, si riduce. Nei primi anni, per una corretta selezione fenotipica multicaratteriale, sono eliminati i cloni con caratteristiche agronomiche indesiderate (selezione negativa), mentre negli anni successivi sono selezionati i cloni con le migliori performance (selezione positiva). Un’alta percentuale di cloni è scartata durante la valutazione della prima generazione di selezione clonale. La selezione per resistenza e qualità, invece, è di solito effettuata nelle ultime generazioni di selezione clonale, quando il numero dei cloni in valutazione si è drasticamente ridotto. In numerosi programmi di miglioramento genetico, per incrementare l’efficienza della selezione, sono adottate procedure di selezione ad hoc: eliminazione (prima del trapianto) delle piantine F1 poco vigorose; eliminazione, in prima generazione clonale, di cloni con colore/forma dei tuberi e profondità degli occhi indesiderati; selezione negativa per la produzione e il peso del tubero nella prima generazione clonale, e per il numero di tuberi nella seconda generazione clonale. L’ultima parte di un programma di miglioramento genetico include il confronto con varietà controllo, il mantenimento di standard fitosanitari elevati, la propagazione dei tuberi-seme e le strategie di marketing. Livello interspecifico. Sebbene la strategia appena descritta sia ancora la più utilizzata, in un numero crescente di programmi di miglioramento si cerca di utilizzare l’immenso patrimonio genetico delle specie selvatiche, soprattutto quelle 2x(2EBN), fornitrici di caratteri (e quindi geni) utili e di diversità allelica. L’uso delle specie diploidi, inoltre, consente ai miglioratori di operare con modelli genetici più semplici basati sull’eredità disomica, meno complicata di quella tetrasomica del livello 4x(4EBN). Ulteriore vantaggio è quello di avere necessità di una popolazione di partenza più ridotta. Il miglioramento genetico interspecifico a livello diploide si basa sul fatto che il modello EBN consente di prevedere l’esito positivo o negativo degli incroci tra specie differenti e quindi di sviluppare opportuni schemi di miglioramento genetico. Esso sfrutta anche i vantaggi dei gameti 2n, molto diffusi nelle specie selvatiche e coltivate di patata, e la relativa semplicità con cui è possibile ottenere aploidi di S. tuberosum. La prima fase di un programma di ibridazione intespecifica basato sull’uso di specie 2x(EBN) consiste nella produzione e nella selezione di aploidi di varietà coltivate. Gli aploidi sono sporofiti con il corredo cromosomico gametico, e nella patata possono essere facilmente ottenuti attraverso incroci 4x × 2x tra le varietà tetraploidi di S. tuberosum (genitore femminile) e genotipi diploidi di S. phureja (genitori maschili). Questi ultimi stimolano lo sviluppo partenogenetico dell’ovocellula che darà uno zigote, e quindi una pianta, con corredo cromosomico 2n=2x=24 ed EBN=2. Gli aploidi selezionati sono in seguito incrociati con le specie selvatiche 2x(2EBN). Gli ibridi interspecifici prodotti da questi incroci hanno il 50% di genoma selvatico. Pertanto, dopo un accurato lavoro di selezione per i caratteri desiderati ed eventualmente altra attività di miglioramento genetico, è necessario ristabilire il corredo cromosomico tetraploide della patata coltivata e ridurre gradualmente il contenuto di genoma selvatico; questo obiettivo è raggiunto attraverso i gameti 2n. Nella fase successiva, infatti, gli ibridi che presentano caratteristiche superiori e che producono gameti 2n sono incrociati con le varietà coltivate 4x(4EBN) per ripristinare la condizione tetraploide (poliploidizzazione sessuale unilaterale) e ridurre la percentuale di genoma selvatico al 25%. La condizione tetraploide può essere raggiunta anche incrociando due ibridi diploidi, uno produttore di ovocellule 2n, e l’altro di polline 2n (poliploidizzazione sessuale bilaterale). È molto importante tenere in considerazione i meccanismi genetici alla base della produzione di gameti 2n, in quanto da essi dipende la quota di eterozigosi trasmessa dai parentali diploidi alla progenie tetraploide. Il meccanismo di restituzione del nucleo in prima divisione consente di trasmettere alla progenie circa l’80% di eterozigosi del genitore. I gameti che si formano sono molto rassomiglianti l’uno con l’altro e al clone parentale da cui derivano. Essi mantengono e trasmettono anche molte interazioni epistatiche, importanti nella massimizzazione dell’eterosi. In presenza, invece, di un meccanismo di restituzione in seconda divisione è trasmesso il 40% dell’eterozigosi parentale e i gameti 2n prodotti sono molto eterogenei e altamente omozigoti. È bene puntualizzare che a volte le barriere di incrocio non consentono di sviluppare programmi di incrocio basati sulla poliploidizzazione unilaterale e bilaterale. Le specie 2x(1EBN), per esempio, non possono essere incrociate con gli aploidi di S. tuberosum 2x(2EBN) a causa del differente EBN. In questi casi si utilizzano schemi di miglioramento genetico ad hoc basati sulle ploidie ponte triploidi e sui gameti 2n. Le prime sono prodotte attraverso incroci 2x(1EBN) × 2x(2EBN) se il parentale 2x(1EBN) produce gameti 2n, oppure tramite incroci 4x(2EBN) × 2x(2EBN) se il parentale 2x(1EBN) non produce gameti 2n e viene sottoposto a un processo di poliploidizzazione somatica che duplica la sua ploidia e il suo EBN. La fase successiva di questo schema è rappresentata dalla produzione di ibridi pentaploidi. Essi sono facilmente ottenuti da incroci 3x(2EBN) × 4x(4EBN) se i parentali triploidi formano gameti 2n, gli unici gameti che garantiscono un rapporto di 2:1 tra EBN materno e paterno nell’endosperma dell’ibrido. È poi relativamente facile procedere con i reincroci, in quanto i pentaploidi hanno un EBN=4 e quindi sono incrociabili con S. tuberosum 4x(4EBN). Ulteriori strategie che possono essere adottate per superare le barriere sessuali sono l’impollinazione con polline mentore, la coltura in vitro dell’embrione immaturo e l’ibridazione somatica.

Colture in vitro

Insieme alle strategie di ibridazione sessuale sono state sviluppate metodologie di miglioramento genetico basate sull’uso delle colture in vitro. Le tecniche di coltura in vitro si basano sulla totipotenza delle cellule vegetali, vale a dire sulla capacità di una singola cellula di rigenerare un organismo completo di tutti gli organi. Nella patata le colture in vitro sono utilizzate di routine per conservare in sanità i genotipi di interesse e per la produzione massale di cloni. Come già avviene per molte altre specie di rilevanza per l’agricoltura, infatti, la coltura di meristemi apicali associata alla termoterapia rappresenta una valida soluzione per il risanamento di varietà virosate. La micropropagazione in vitro, inoltre, offre la possibilità di produrre migliaia di copie della stessa varietà in tempi brevi; essa è normalmente utilizzata dalle aziende sementiere che producono tuberi-seme certificati. Le colture in vitro sono impiegate anche per produrre variabilità genetica. Esse, infatti, possono indurre mutazioni da sfruttare nel miglioramento genetico. Tale variabilità, definita somaclonale, dipende molto fortemente dal tipo di espianto utilizzato, dal genotipo, dalla composizione del substrato artificiale e dalla lunghezza del periodo di permanenza dell’espianto sul substrato. Attraverso le colture in vitro di antere o microspore, inoltre, è possibile produrre piante aploidi. La totipotenza delle microspore contenute nelle antere, infatti, può portare alla rigenerazione di plantule con corredo cromosomico gametico. Da genotipi diploidi (2n=2x=24), quindi, è possibile ottenere aploidi con corredo cromosomico somatico 2n=1x=12 e da tetraploidi (2n=4x=48) genotipi 2n=2x=24. Si ricorre a questo metodo di produzione di aploidi quando gli incroci con S. phureja non hanno esito positivo. Considerando che una singola antera contiene migliaia di microspore, si capisce come questa strategia di aploidizzazione sia potenzialmente molto efficiente. La produzione di aploidi tramite coltura in vitro dipende in primo luogo dal genotipo della pianta donatrice di antere. Il carattere, infatti, è controllato geneticamente, con ogni probabilità da numerosi geni, ed è quindi trasmissibile alle progenie. Sono stati definiti numerosi protocolli per la coltura in vitro di antere e microspore di patata; alcuni fanno uso di substrati liquidi, altri di substrati agarizzati, con o senza aggiunta di carbone attivo. Taluni prevedono la permanenza delle antere per qualche giorno a basse temperature (4-6 °C), altri invece non necessitano di alcun trattamento. Oltre a essere utilizzati nel miglioramento genetico a livello interspecifico (vedi il paragrafo precedente), gli aploidi di S. tuberosum sono importanti strumenti per lo studio dell’ereditarietà dei caratteri, la costruzione di mappe genetiche e la comprensione dell’effetto delle mutazioni. Una delle più interessanti applicazioni delle colture in vitro è quella relativa alla produzione di ibridi attraverso la fusione di protoplasti (cellule somatiche prive di parete cellulare) isolati da due parentali distinti. Questa tecnica, definita fusione somatica, è utilizzata soprattutto quando le barriere interspecifiche di incompatibilità non consentono la produzione di ibridi sessuali tra due specie. Ibridi somatici sono stati ottenuti tra la patata coltivata e numerose specie selvatiche, tra cui S. acaule, S. brevidens, S. bulbocastanum, S. cardiophyllum, S. commersonii e S. sancta-rosae. Dopo l’isolamento e la coltura dei protoplasti dei due parentali (in genere S. tuberosum e una specie selvatica), si induce la fusione tra due protoplasti appartenenti alle due specie. Il metodo più efficiente per la fusione di protoplasti è l’elettrofusione. I protoplasti dei due parentali sono mescolati e, grazie a un campo elettrico a corrente alternata, essi si dispongono a catenelle, allineandosi lungo le linee di forza del campo elettrico. A questo punto sono forniti impulsi elettrici ad alta tensione che favoriscono la fusione di due protoplasti adiacenti, con conseguente mescolamento di citoplasma e nucleo. Le cellule ibride risultanti dalla fusione, denominate prodotto di eterofusione, in opportune condizioni di crescita su substrato artificiale formano una massa di cellule indifferenziate (callo), da cui possono essere rigenerati genotipi ibridi. Essi sono chiamati somatici per differenziarli da quelli sessuali, che derivano dall’unione di due gameti. Con la fusione somatica si ottiene non solo il superamento delle barriere sessuali, ma anche la combinazione integrale di due genomi nucleari eterozigoti senza ricombinazione meiotica; ciò è molto importante per i caratteri a controllo poligenico. La fusione somatica, inoltre, porta al mescolamento sia del nucleo sia del citoplasma dei due parentali. Ciò determina la comparsa di ulteriore variabilità genetica, in quanto il DNA presente nei mitocondri e nei cloroplasti può andare incontro a riarrangiamenti e ricombinazioni. Questa è una delle novità della fusione somatica rispetto all’ibridazione sessuale, che, com’è noto, per i geni localizzati nel genoma degli organelli citoplasmatici prevede un’eredità di tipo materno.

Ingegneria genetica

Alcune difficoltà legate al miglioramento genetico convenzionale (tempi lunghi, eredità tetrasomica) e all’uso delle specie selvatiche (introgressione di geni indesiderati) possono essere superate con il contributo dell’ingegneria genetica; essa comporta la manipolazione diretta di singoli geni e il loro trasferimento in pianta. Il maggiore vantaggio di questa strategia è dato dal fatto che il genotipo dell’organismo ricevente resta pressoché intatto, in quanto sono trasferiti solo singoli geni e non genomi completi. Nell’ambito delle strategie di miglioramento genetico l’ingegneria genetica è tra quelle che meglio sfruttano i progressi della genomica strutturale e funzionale. Il trasferimento di geni in patata mediante ingegneria genetica è stato realizzato principalmente attraverso la tecnologia del DNA ricombinante; essa prevede l’integrazione del gene di interesse nel DNA plasmidico di Agrobacterium tumefaciens. Il plasmide con il gene di interesse (plasmide ricombinante) è reinserito nel batterio, che provvede poi, mediante infezione di espianti vegetali messi in co-coltura, a veicolare il gene nel genoma nucleare di queste cellule. Sfruttando il fenomeno della totipotenza e in opportune condizioni di coltura in vitro, le cellule trasformate possono quindi rigenerare piante transgeniche. I prodotti dell’ingegneria genetica sono valutati fenotipicamente e molecolarmente per identificare i migliori genotipi e per evidenziare eventuali effetti indesiderati imputabili al processo di trasformazione genetica o alla rigenerazione in vitro; è infatti possibile la comparsa di fenotipi non attesi a causa di effetti pleiotropici del transgene o della variabilità somaclonale che spesso accompagna le colture in vitro. Oltre che a valutare la produzione di tuberi, si provvede all’identificazione del numero di copie del transgene che si sono inserite e a studi sull’espressione genica, importanti per verificare la comparsa di fenomeni di silenziamento genico parziale o totale e la stabilità di espressione del transgene. Per confermare l’equivalenza sostanziale delle piante transgeniche rispetto alla varietà di partenza, inoltre, sono condotte accurate analisi metaboliche e proteomiche. Il numero di geni disponibili per la trasformazione in patata è in continua crescita e comprende, tra gli altri, geni di resistenza a virus, funghi e batteri, geni che modificano la composizione dell’amido e geni coinvolti nei meccanismi di resistenza a stress abiotici. Questi geni sono stati clonati sia da specie selvatiche di patata sia da altri organismi, vegetali e non. Da S. bulbocastanum, per esempio, sono stati clonati due geni, Rpi-blb1 (sinonimo RB) e Rpi-blb2, che conferiscono resistenza orizzontale a P. infestans. Da S. spegazzinii, invece, è stato clonato un gene (denominato Gro1) che determina la resistenza al nematode G. rostochiensis. Numerosi geni di resistenza a stress biotici sono stati clonati dal pomodoro, specie geneticamente molto vicina alla patata. Tra questi si segnalano quelli che conferiscono la resistenza a Cladosporium fulvum (gene Cf-9), a Fusarium oxysporum (gene I-2) e a Pseudomonas syringae (gene Pto). Dal batterio Bacillus thuringiensis, inoltre, sono stati clonati geni che codificano proteine tossiche per le larve di insetti (lepidotteri, coleotteri, ditteri). Dopo essere state ingerite dalla larva, queste proteine sono degradate nell’apparato digerente e producono sostanze tossiche che hanno specifica attività insetticida contro le larve di insetti. Da Phyllomedusa bicolor, una rana arboricola, è stato invece clonato un gene che codifica per un peptide ad attività antimicrobica, la dermaseptina B1, tale da conferire resistenza a peronospora e fusariosi. L’ingegneria genetica è tradizionalmente considerata la strategia che consente di inserire un gene esogeno, e quindi di far acquisire una nuova caratteristica, alla varietà modificata. Tuttavia, essa consente anche di agire su un gene endogeno sopprimendo o riducendo drasticamente la sua espressione. Quando è conosciuta la via biochimica che porta alla sintesi di un particolare metabolita, infatti, la tecnologia RNA antisenso permette di bloccare l’attività di un determinato gene in essa coinvolto, e quindi di intervenire sulla via metabolica, modificando il prodotto finale. Varietà resistenti all’ammaccatura, per esempio, sono state ottenute silenziando il gene della polifenol-ossidasi; allo stesso modo, silenziando il gene della zeaxantina-epoxidasi è stato possibile costituire genotipi con alto contenuto in carotenoidi. Recentemente, attraverso RNA antisenso a carico del gene GBSS, è stata rilasciata una nuova varietà di patata (Amflora) che produce un amido ricco di amilopectina e povero di amilosio. L’amilopectina è un polimero di glucosio a catena ramificata, mentre l’amilosio è un polimero dello stesso zucchero ma ha una catena lineare. Il rapporto tra queste due componenti è molto importante per gli usi industriali dell’amido. Attualmente i ricercatori stanno lavorando per cercare di superare alcune delle problematiche emerse con l’uso delle piante transgeniche (per esempio diffusione dei transgeni, uso di geni marcatori) e per ottenere prodotti specifici, quali anticorpi e vaccini. La trasformazione del DNA plastidiale, in quest’ottica, potrebbe offrire particolari vantaggi. Il sistema è potenzialmente molto efficiente in quanto, data la numerosità di questi organelli in ogni cellula, l’espressione del transgene può essere molto maggiore (anche 50 volte) di quella ottenibile con la trasformazione nucleare; ciò è molto importante se si vuole utilizzare la patata come bioreattore per produrre molecole specifiche utili per l’uomo in grandi quantità. Tra gli altri vantaggi, c’è quello legato all’impossibilità di diffusione del transgene tramite polline. Com’è noto, infatti, il gamete maschile generalmente trasmette il genoma nucleare del genitore ma non quello citoplasmatico.

Marcatori molecolari e selezione assistita

 

Tra i prodotti più interessanti della biologia molecolare ci sono i marcatori molecolari. Essi sono utilizzati per studiare la variabilità direttamente a livello del DNA, superando le difficoltà della valutazione fenotipica, molto condizionata dall’ambiente. Nella patata i marcatori molecolari sono utilizzati per valutare e caratterizzare la variabilità genetica, per studi tassonomici e filogenetici, per localizzare geni di interesse, per costruire mappe genetiche e per monitorare l’introgressione di geni utili da specie selvatiche a quelle coltivate. Un’importante applicazione dei marcatori molecolari è quella relativa alla cosiddetta selezione assistita positiva. I marcatori molecolari (quindi sequenze di DNA) strettamente associati ad alleli di interesse non seguono il principio dell’assortimento indipendente ma co-segregano con tali alleli. È pertanto possibile procedere velocemente e accuratamente, grazie ad analisi molecolari che evidenziano la presenza/assenza di quel marcatore, alla selezione indiretta degli individui con l’allele (e quindi il carattere) desiderato. Con la selezione assistita si evita di dover attendere l’espressione fenotipica del carattere, e si è quindi svincolati da procedure di selezione elaborate, lunghe e costose, oltre che dall’interazione genotipo-ambiente. Nel caso di marcatori associati a geni di resistenza a stress biotici, per esempio, la selezione può essere effettuata in assenza del patogeno; ciò consente di evitare i test di patogenicità, riducendo i tempi e gli errori di classificazione delle piante, nonché gli spazi necessari per la crescita del materiale vegetale. L’analisi molecolare può essere effettuata in fase precoce di sviluppo della pianta. Ciò è particolarmente vantaggioso se il lavoro di selezione deve essere effettuato su un numero di piante molto elevato (per esempio una progenie segregante) oppure se il carattere si manifesta tardivamente nel ciclo vegetativo (per esempio a livello di tubero). Le applicazioni dei marcatori molecolari per la selezione assistita possono essere svariate. Tra esse il piramidaggio di uno o più geni di resistenza in un unico genotipo, l’identificazione dei prodotti di eterofusione, la selezione per caratteri poligenici grazie all’identificazione di specifici QTL. Nella patata sono stati mappati numerosi geni e QTL di interesse coinvolti nel controllo di caratteri monogenici e poligenici. Ciò ha portato all’identificazione di marcatori molecolari di semplice utilizzazione (per esempio quelli sviluppati tramite PCR) associati a singoli geni che conferiscono resistenza ai virus, a Globodera rostochiensis, a Meloidogyne chitwoodi e a P. infestans, o che controllano caratteristiche agronomiche particolari. Sono stati sviluppati anche alcuni semplici marcatori molecolari associati a QTL coinvolti nella resistenza poligenica a peronospora e nematodi. Esempi di marcatori molecolari utili per la selezione assistita sono ADG2 (un marcatore CAPS) associato al gene Ryadg che conferisce resistenza al virus X, CP53 (un marcatore RFLP) associato al gene Rpi-blb1 di resistenza a P. infestans, Stm3016 (un marcatore SSR) associato a un QTL di resistenza a P. infestans. La selezione assistita può essere effettuata anche quando non si dispone di marcatori molecolari associati al gene di interesse. Con l’identificazione di marcatori molecolari specie-specifici è possibile, infatti, stimare il contenuto di genoma selvatico in ibridi tra S. tuberosum e una specie selvatica. Ciò permette di effettuare una ”selezione assistita negativa”, che consiste nell’eliminazione dei genotipi che presentano la maggiore percentuale di genoma selvatico e nel mantenimento di quelli che, insieme ai caratteri desiderati, hanno anche la minore percentuale di genoma selvatico. Con questo tipo di approccio, pertanto, la selezione è effettuata genotipicamente ”contro” il genoma della specie selvatica. Si riduce così il rischio di selezionare ibridi che, insieme ai caratteri desiderati, hanno anche caratteristiche indesiderate (per esempio elevato contenuto in glicoalcaloidi) derivanti dalla specie selvatica donatrice.


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