Volume: l'uva da tavola

Sezione: ricerca

Capitolo: miglioramento genetico

Autori: Stella Grando, Manna Crespan, Marica Gasparro

Introduzione

Il miglioramento genetico delle piante consiste nella produzione di nuove varietà che meglio soddisfino le esigenze di produttività, di adattabilità a condizioni ambientali limitanti, di resistenza a patogeni e parassiti e di risposta alle richieste del mercato. Ultimamente, soprattutto a causa di una sovrabbondanza di produzioni che caratterizza molti settori della nostra agricoltura, gli obiettivi del miglioramento genetico si sono spostati sulle caratteristiche qualitative. Per esempio, si cerca di costituire varietà dotate di maggiori sostanze nutraceutiche, con caratteristiche organolettiche di pregio e potenziate dal punto di vista salutistico. Di grande attualità sono anche gli obiettivi finalizzati a una maggiore sostenibilità dell’agricoltura, mediante il ricorso a varietà resistenti ai parassiti, per ridurre l’utilizzo di trattamenti fitosanitari. Il miglioramento genetico della vite è iniziato, come per tutte le piante, con la sua coltivazione, cioè con la selezione di piante spontanee nei boschi. Nell’ambito intravarietale il miglioramento è proseguito grazie al lavoro dei viticoltori che hanno selezionato i biotipi migliori e scartato i peggiori (selezione massale e selezione clonale). Questa opera prosegue anche ai nostri giorni, ma ha il grosso limite della scarsa variabilità genetica sulla quale si applica la selezione dei biotipi migliori. Dalla seconda metà dell’800, con le esperienze di Mendel, lo sviluppo della genetica ha permesso di sviluppare programmi di miglioramento genetico più razionali, basati sugli incroci tra varietà della stessa specie. Il contributo di questa ibridazione intraspecifica è stato di grande rilievo, soprattutto per le uve da tavola. Nel genere Vitis sono presenti molti caratteri desiderabili per le cultivar di vite, inoltre numerose varietà di Vitis vinifera (specie che rappresenta probabilmente il 98% della produzione mondiale, mentre il restante 2% è da attribuire alle specie native o a loro ibridi) portano tratti che sarebbero interessanti se combinati in un unico genotipo. Nonostante la vite presenti questi vantaggi per il selezionatore, i tempi lunghi del suo ciclo vitale, la sua elevata eterozigosi e la forte depressione da inbreeding (autofecondazione) hanno sempre ostacolato l’ottenimento per incrocio di genotipi pianificati, modificati solo nei caratteri d’interesse. Con l’avvento delle biotecnologie, questi limiti biologici hanno incominciato a essere superati, in quanto la biologia molecolare ha messo a disposizione interessanti strumenti per un miglioramento genetico vegetale mirato. In particolare, l’avvento dei marcatori molecolari ha aperto una nuova strada nel miglioramento genetico, quella della selezione assistita da marcatori (MAS, Marker-Assisted Selection). L’identificazione di un marcatore molecolare associato al gene che controlla un carattere di interesse permette di fare la selezione per il carattere utilizzando il marcatore associato, sostituendo così l’analisi fenotipica. L’uso di marcatori molecolari associati a caratteri desiderati consente, quindi, di migliorare l’efficienza del breeding tradizionale, soprattutto per una specie poliennale come la vite. L’analisi molecolare, infatti, può essere eseguita in qualsiasi momento, anche quando le piante da valutare sono giovani e non hanno ancora manifestato il carattere da selezionare. Inoltre, una serie di marcatori associati a caratteri di interesse permette di controllare molti semenzali subito dopo la germinazione e di selezionare solo i ricombinanti che presentano tutti i caratteri desiderati, con evidenti risparmi di tempo, di costi e di spazio. Negli ultimi anni, lo sviluppo di marcatori molecolari ha permesso anche di utilizzare un valido approccio per l’analisi della diversità genetica del germoplasma viticolo, l’identificazione varietale e la ricostruzione dei rapporti di parentela tra le cultivar. Tradizionalmente, l’identificazione delle varietà di vite si è basata su metodi ampelografici e ampelometrici, che descrivono tratti fenotipici della pianta, come la morfologia delle foglia e dei grappoli. Grazie all’applicazione di test basati sul DNA, il riconoscimento dei vitigni è diventato più oggettivo in quanto le differenze a livello del DNA (polimorfismi) non sono influenzabili dall’ambiente o dallo stadio di sviluppo della pianta. La possibilità di avere l’intero germoplasma viticolo descritto con profili molecolari molto informativi, facili da confrontare e rapidi da ottenere è una buona base di partenza per qualsiasi programma di miglioramento genetico. Inoltre, la conoscenza dell’intera sequenza del genoma di vite ha messo a disposizione della ricerca nuove informazioni che permetteranno una migliore comprensione delle basi molecolari della biologia della pianta. Questo renderà possibile la realizzazione di programmi di miglioramento genetico sempre più ambiziosi, specifici ed efficienti.

Miglioramento genetico delle uve da tavola

L’uva da tavola è un prodotto più dinamico rispetto al vino, infatti il consumatore accetta con maggiore facilità la sostituzione di una varietà da tavola con un’altra. Negli ultimi anni, per favorire una migliore collocazione dell’uva da tavola italiana sui mercati nazionali e internazionali, il patrimonio varietale ha subito un notevole cambiamento. Le richieste del mercato, infatti, sono indirizzate sempre di più verso le uve da tavola apirene, mentre l’Italia produce per la quasi totalità uve con semi. L’introduzione di nuove varietà, in particolare di uva apirena, costituisce, quindi, un contributo importante alla soluzione dei problemi del settore. Gli obiettivi generali nei programmi di breeding per l’uva da tavola possono essere indicati nella ricerca di una migliore qualità gustativa, nell’ampliamento dell’epoca di maturazione e nella selezione di cultivar precoci e tardive. L’ideotipo al quale mira il breeder deve considerare sia le prestazioni agronomiche sia la qualità del prodotto. Dal punto di vista agronomico occorre disporre di cultivar dotate di buona fertilità, di stabilità nella produzione (sia tra le diverse annate sia tra ambienti diversi) e di un buon equilibrio tra fase vegetativa e fase di accumulo. È importante anche selezionare vitigni resistenti o tolleranti nei confronti dei principali patogeni e parassiti, così da contenere il numero di trattamenti chimici da effettuare, nell’ottica di un’agricoltura più sostenibile. Dal punto di vista qualitativo, i caratteri specifici di maggiore interesse per il miglioramento genetico delle uve da tavola sono: – apirenia; – precocità e tardività di maturazione; – aspetto attraente del frutto (come grappolo mediamente spargolo, dimensione e uniformità degli acini, colore brillante della buccia, forme particolari ecc.); – croccantezza e consistenza della polpa; – aromi e sapori particolari, uniti alla dolcezza; – resistenza alla conservazione e al trasporto (aderenza al pedicello). La creazione di varietà apirene attraverso i metodi convenzionali di breeding presenta alcuni inconvenienti dovuti all’impossibilità di utilizzare viti apirene come genitori femminili. Le varietà apirene vengono utilizzate solo come genitori maschili in tali incroci, il che riduce la possibilità di ottenere un maggior numero di individui apireni nella progenie. L’incrocio tra varietà apirene è possibile solo mediante la coltura in vitro degli embrioni. La procedura di routine prevede le seguenti fasi: demasculazione e impollinazione manuale, coltura degli ovuli abortivi, estrazione degli embrioni, germinazione degli embrioni e conversione in plantule. La tecnica dell’estrazione degli embrioni (embryo rescue) è uno strumento fondamentale nel breeding delle uve apirene e ha permesso di ottenere popolazioni sperimentali per l’analisi dei fattori genetici e ambientali che controllano l’apirenia. Parallelamente alle strategie di breeding convenzionale sono state sviluppate tecnologie di trasformazione, mediante tecniche di ingegneria genetica, per il trasferimento del carattere apirenia nell’uva da tavola. Comunque nessuno di questi genotipi viene coltivato per un’utilizzazione commerciale. Negli ultimi anni, come già detto, si è sviluppato notevolmente l’uso di marcatori molecolari per facilitare il lavoro di miglioramento genetico. Pertanto, anche nella vite questi marcatori potranno essere utilizzati sia per lo studio dell’ereditarietà sia per la selezione di genotipi di uva da tavola apirena. L’apirenia è stato un carattere molto studiato negli ultimi 50 anni e sono stati prodotti diversi modelli per spiegare le sue basi genetiche. Si passa dal controllo di un singolo gene dominante, a due geni dominanti complementari, oppure a un gene recessivo o a due geni recessivi complementari. Più recentemente, si sono ipotizzati anche tre geni recessivi indipendenti sotto il controllo di un gene di regolazione dominante.

Identificazione varietale e relazioni di pedigree

L’analisi del DNA ha consentito considerevoli progressi scientifici e applicativi anche nel settore viticolo. In particolare oggi è possibile riprodurre in provetta migliaia di copie di porzioni di DNA particolarmente informative, attraverso una tecnica chiamata PCR (Polymerase Chain Reaction, reazione a catena della DNA polimerasi). In tal modo, questi tratti di DNA, che sono detti in gergo tecnico “marcatori”, diventano riconoscibili e analizzabili. Tra i vari marcatori messi a punto e studiati a partire dagli anni ’80, i microsatelliti sono diventati quelli più popolari per l’identificazione delle varietà di vite a livello mondiale. Sono conosciuti anche con altri nomi, come SSR (Simple Sequence Repeats) e STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site), che fanno riferimento al fatto che sono caratterizzati da unità di 1-6 nucleotidi, ripetute di seguito un certo numero di volte. La loro utilità deriva dal fatto che, esaminando lo stesso tratto di DNA in individui diversi, il numero di ripetizioni può cambiare determinando differenze di lunghezza che sono misurabili sperimentalmente (alleli). I marcatori microsatellite sono ampiamente distribuiti nei genomi nucleari degli eucarioti e si trovano anche nel DNA dei cloroplasti e dei mitocondri. Sono codominanti, quindi è possibile distinguere le due varianti alleliche (eterozigosi), che nella vite sono molto comuni, raddoppiando il potere informativo rispetto ai marcatori dominanti. Inoltre, poiché vengono ereditati secondo le leggi di Mendel, si possono seguire nelle progenie degli incroci, permettendo la ricostruzione dei pedigree e la produzione di mappe genetiche.

Come si realizza l’identificazione varietale
L’analisi del DNA con i marcatori microsatellite si è rivelata uno strumento di indagine prezioso per contribuire all’identificazione varietale e per chiarire i rapporti di parentela tra i vitigni. Gli SSR, infatti, definiscono il profilo molecolare varietale, cioè riconoscono gli individui che sono derivati per propagazione vegetativa da uno stesso capostipite iniziale. L’analisi del DNA con marcatori microsatellite viene impiegata per l’identificazione varietale confrontando il profilo della varietà incognita con quelli delle cultivar note, raccolti in appositi archivi. Dato l’elevato potere discriminante di questi marcatori, due piante diverse che condividono lo stesso profilo molecolare appartengono di fatto allo stesso vitigno. Una decina di marcatori, accuratamente selezionati, sono sufficienti per dare risposte assolutamente attendibili, con un margine di errore molto vicino allo zero. Via via che gli archivi molecolari si arricchiscono di informazioni, il confronto dei vitigni risulta agevolato e si possono ricavare informazioni su sinonimie e omonimie da verificare e valutare alla luce delle conoscenze ampelografiche e storiche. I mutanti somatici non sono distinguibili con questi marcatori, un classico esempio è rappresentato dalle varianti a bacca rossa dell’Italia e della Baresana, che hanno lo stesso profilo SSR delle rispettive cultivar a bacca bianca. Tuttavia, sono stati messi a punto recentemente marcatori diversi dai microsatelliti che consentono di identificare anche queste varianti, analizzando il DNA delle foglie. La distinzione dei cloni con gli SSR è possibile solo occasionalmente; spesso gli alleli varianti sono presenti in forma chimerica, cioè si trovano solo in alcune porzioni del tessuto della pianta e questo porta alla presenza di alleli addizionali nello stesso individuo.

Come si realizza l’analisi di pedigree
Gli stessi marcatori SSR si sono rivelati di grande utilità nella ricostruzione dei rapporti di parentela tra i vitigni. Negli incroci, infatti, gli alleli vengono ereditati per metà dal portaseme (madre) e per metà dall’impollinante (padre). Analizzando un congruo numero di marcatori, normalmente nell’ordine di alcune decine, si può valutare se esistono dei legami di parentela di primo grado, del tipo genitore-figlio, e, con un po’di fortuna, ricostruire gli alberi genealogici delle varietà attualmente coltivate. Nel caso delle uve da tavola, molti pedigree sono noti in letteratura perché si tratta di varietà prodotte da incroci antropici. Le indagini molecolari ne hanno confermati molti, mentre ne hanno messi in discussione altri. Per fare qualche esempio, l’Italia risulta effettivamente originata dall’incrocio Bicane x Moscato d’Amburgo, mentre quest’ultimo deriva da Moscato d’Alessandria (Zibibbo) x Schiava grossa. Cardinal, ritenuta un incrocio tra Flame Tokay e Alphonse Lavallée, si è generata invece da Alphonse Lavallée x Regina dei vigneti. Poiché i cloroplasti vengono ereditati nella vite per via materna, se i genitori individuati sono polimorfici a livello di questi organelli, è possibile anche distinguere quale dei due ha avuto il ruolo di portaseme e quale di impollinante. Nella tabella a lato sono riportati i pedigree di alcune delle varietà di uva da tavola più note, confermati o rivisti alla luce dei risultati delle indagini molecolari. Questi esempi mettono in luce i legami genetici tra le varietà da tavola e quelle da vino e ci fanno anche conoscere l’ordine di apparizione dei vitigni. Tuttavia, nel caso di varietà nate da incroci spontanei non possiamo stabilire delle “date di nascita”, ma solo fare delle supposizioni appoggiandoci alle fonti storiche disponibili.

Base genetica di caratteri importanti per le uve da tavola

Mappe molecolari e analisi QTL
L’ampia disponibilità di marcatori molecolari per l’analisi del genoma di vite ha offerto negli ultimi anni la possibilità di affrontare lo studio del determinismo genetico di caratteri complessi. Gli obiettivi dei programmi di miglioramento genetico per le varietà di uva da tavola riguardano, infatti, per la maggior parte tratti fenotipici a base poligenica e quantitativa. Numerosi geni possono contribuire con diverso effetto alla variazione di un fenotipo. Ottenere la combinazione degli alleli favorevoli ai loci genetici responsabili del carattere d’interesse è dunque lo scopo finale del breeding. Applicando marcatori del DNA associati alle singole componenti di un tratto quantitativo (QTL) si può arrivare a una più rapida ed efficace individuazione dei genotipi desiderati tra i semenzali prodotti dagli incroci. A questo punto l’ampiezza delle popolazioni da selezionare può essere molto estesa perché, come già detto, la selezione precoce riduce i costi di mantenimento degli ibridi mentre aumentano le chance di ottenere individui con gli assortimenti genici preferiti. Per affrontare l’analisi genetica quantitativa in vite, sono state create nell’ultimo decennio numerose mappe molecolari di associazione basate su popolazioni segreganti ottenute da incroci fra parentali con caratteristiche divergenti. La successiva misurazione dei tratti fenotipici negli individui di queste progenie sperimentali ha portato all’identificazione di alcuni importanti QTL nei diversi background genetici studiati. Allo stato attuale è già disponibile una serie di marcatori molecolari per applicazioni di MAS. La caratterizzazione di alcune regioni genomiche risultate ripetutamente associate a tratti importanti come per esempio l’apirenia renderà presto disponibili anche geni per la trasformazione genetica delle varietà. Diversi esperimenti indipendenti hanno affrontato con l’approccio del QTL mapping lo studio del controllo genetico delle dimensioni dell’acino, il contenuto di semi, la composizione terpenica e le epoche fenologiche in varietà per uve da tavola. Le popolazioni segreganti utilizzate sono state diverse e risultati incoraggianti sono emersi dagli incroci di parentali apireni o parzialmente apireni come Ruby Seedless x Thompson Seedless, oppure (Dattier de Beyrouth x 75 Pirovano) x (Alphonse Lavallée x Sultanina) che hanno comportato l’impiego della tecnica di embryo rescue in vitro. Altri incroci che hanno prodotto evidenze genetiche piuttosto robuste sono stati Dominga x Autumn Seedless e Italia x Big Perlon. Tutti questi esperimenti hanno identificato un QTL maggiore per la presenza di semi e il peso dell’acino sul gruppo di associazione 18 del genoma di vite, a conferma della correlazione sfavorevole già osservata dai breeder tra l’apirenia e la dimensione della bacca. Tuttavia, l’identificazione di ulteriori QTL con effetti minori sul contenuto di semi, ma non sul peso dell’acino, e posizionati in altre regioni genomiche, suggerisce la possibilità pratica di dissociare la relazione negativa tra i due caratteri nei programmi di miglioramento genetico. Il numero di semi, il peso secco dei semi e l’epoca di fioritura risultano controllati da un QTL posizionato sul gruppo di associazione 2 nell’analisi della popolazione ottenuta da Italia x Big Perlon. Lo studio di questa progenie ha permesso anche di confermare l’esistenza di un determinante genetico importante per l’aroma moscato delle uve nel gruppo di associazione 5 del genoma di vite che in certe annate arriva a spiegare fino al 90% della variazione del contenuto dei composti monoterpenici e rappresenta un concreto esempio di marcatore efficace per la MAS.

Geni candidati
Con la disponibilità dell’intera sequenza del genoma di vite, diventa più diretta l’individuazione dei geni putativamente coinvolti nel controllo genetico dei caratteri che interessano il breeding. Le analisi QTL hanno finora indicato regioni genomiche che con alta probabilità sono implicate nel determinismo delle epoche di fioritura, invaiatura e maturazione, di alcune caratteristiche morfologiche dell’acino, compresa la presenza dei semi, e dell’accumulo di composti aromatici. Altri lavori sperimentali attualmente in corso mirano a delucidare le basi genetiche della resistenza alle patologie fungine. Il passo successivo sarà l’identificazione delle sequenze nucleotidiche responsabili della variazione fenotipica, al fine di descrivere le varianti alleliche dei fattori genetici interessanti per inserire gli alleli favorevoli nelle nuove varietà. In base al coposizionamento di alcuni geni in corrispondenza della massima probabilità dei QTL, è stato possibile ipotizzare il coinvolgimento di alcune proteine nella variazione dei caratteri indagati nella popolazione sperimentale Italia x Big Perlon. Per il periodo di fioritura, l’intervallo tra fioritura e invaiatura, il numero di semi e il peso secco dei semi sul gruppo di associazione 2 è stato predetto, per esempio, un gene che codifica per un fattore di trascrizione del tipo YABBY, per il quale in letteratura è stato riportato un ruolo nella crescita, nella formazione e nello sviluppo del fiore e anche nella morfogenesi precoce dell’acino d’uva. In corrispondenza dei QTL coincidenti per il peso della bacca, il peso fresco e secco dei semi sul gruppo di associazione 18 è stato predetto invece un gene che codifica per una proteina di Vitis vinifera del tipo MADS-box 5, a cui in letteratura è stato assegnato un ruolo nello sviluppo dell’ovulo e del seme. Relativamente all’aroma moscato, si è visto che l’enzima 1-deoxyD-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) è codificato da un gene che risiede proprio nel tratto cromosomico delimitato dal QTL identificato sul gruppo 5. Da pochi anni si sa che questa proteina svolge un ruolo catalitico nel primo e limitante step della biosintesi plastidiale dell’Isopentenil difosfato, il precursore dei terpeni nelle cellule vegetali.

Conclusioni

Interessanti progressi sono stati ottenuti negli ultimi anni per assistere il miglioramento genetico delle varietà per uve da tavola. La possibilità di scegliere i parentali sulla base delle configurazioni alleliche più interessanti e di seguire la trasmissione genetica dei caratteri con marcatori del DNA, in modo da poter selezionare precocemente le combinazioni genotipiche desiderate, rappresenta un potente strumento oggi a disposizione del breeder. In parallelo, la comprensione dei meccanismi genetici che controllano la variazione fenotipica potrà fornire importanti elementi anche per la creazione di varietà geneticamente modificate e nel contempo indicare nuove soluzioni gestionali per la produzione ottimale dei vigneti.


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