Volume: il carciofo

Sezione: ricerca

Capitolo: biotecnologie

Autori: Raffaella Tavazza, Paola Crinò, Giorgio Ancora, Mario Augusto Pagnotta

Introduzione

Con il termine di biotecnologie (tecnologie biologiche) si indicano tutte le applicazioni tecnologiche della biologia. Tra le definizioni disponibili, la più completa è senza dubbio quella adottata dalla Convenzione sulla Diversità Biologica UN, ossia: “La biotecnologia è l’applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, degli organismi viventi o di derivati di questi per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico”. Le biotecnologie combinano molte discipline quali la genetica, la biologia molecolare, la biochimica e la biologia cellulare. Nel carciofo le biotecnologie sono state usate principalmente per la micropropagazione, il risanamento da virus, l’ottenimento di aploidi, l’induzione di variabilità genetica mediante mutagenesi e la caratterizzazione molecolare. Il loro utilizzo è ancora in una fase iniziale rispetto ad altre specie vegetali e la loro applicazione è differente nelle diverse tipologie di carciofo; in particolare, è in uno stadio più avanzato per le tipologie primaverili, mentre devono ancora essere messi a punto alcuni protocolli sperimentali per quelle rifiorenti. Vi è quindi la necessità di continuare e approfondire l’utilizzo delle moderne metodologie ed estenderlo a tutte le tipologie di carciofo.

Micropropagazione

La propagazione in vitro, nota anche con il termine di micropropagazione o propagazione meristematica, è oggi la tecnica più all’avanguardia nel campo della moltiplicazione delle piante. Essa consente la produzione rapida di un gran numero di individui (cloni) genotipicamente e fenotipicamente identici alla pianta selezionata per caratteristiche fisiologiche e produttive di pregio, con un processo di propagazione vegetativa simile a quello della talea. Contrariamente alle tecniche tradizionali di propagazione, che si effettuano in serra o in campo, la micropropagazione viene condotta in condizioni strettamente asettiche e con l’impiego di camere di crescita caratterizzate da parametri di luce e temperatura controllati.

Principali fasi della micropropagazione

A partire dalla coltura in vitro di un meristema, o di un apice vegetativo, è possibile ottenere un germoglio che, in opportune condizioni di coltura, viene indotto a proliferare sviluppando le gemme ascellari presenti alla base di ogni foglia. I germogli proliferati, dopo diversi cicli di moltiplicazione, possono essere successivamente indotti a formare le radici mediante trasferimento su un terreno di coltura idoneo, originando una piantina completa. Il passaggio della pianta dalla coltura in vitro alla serra è particolarmente delicato in quanto la pianta deve riacquisire le proprie funzioni fisiologiche di traspirazione e fotosintesi. La propagazione meristematica, messa a punto per le orchidee negli anni ’50 da George Morel, negli Stati Uniti, è stata gradualmente estesa a un numero sempre crescente di piante a propagazione sia vegetativa sia sessuata e consente di ottenere in un anno centinaia di migliaia di piante tutte uguali a partire da un singolo germoglio, rendendo possibile in tal modo la moltiplicazione a livello industriale. Si tratta di un procedimento particolarmente utile per la moltiplicazione rapida dei materiali genetici che, con l’uso delle tecniche tradizionali di propagazione, richiederebbero molti anni per poter raggiungere gli agricoltori e il mercato. La coltura in vitro di meristemi è inoltre un potente mezzo per il risanamento delle piante dai virus, in quanto il meristema apicale utilizzato per iniziare la coltura (0,2-0,8 mm) è un tessuto composto da poche centinaia di cellule in veloce moltiplicazione e non ancora infette dai virus. Questo rende possibile la produzione e la distribuzione al sistema agricolo di materiale di propagazione di qualità con effetti positivi sulla produzione. L’applicazione della coltura in vitro al carciofo è iniziata negli anni ’70 ed è stata dapprima finalizzata all’ottenimento di materiale esente da fitopatie, quali funghi, batteri e virus. Successivamente sono state messe a punto metodologie di propagazione in vitro che hanno consentito il raggiungimento di tassi di moltiplicazione più elevati rispetto a quelli ottenuti con i metodi tradizionali (carducci/ovoli), una maggiore vigoria e, di riflesso, una più elevata produttività. Nella micropropagazione del carciofo, il materiale di partenza è costituito da meristemi o apici vegetativi prelevati dai carducci. Durante il processo colturale, si possono presentare diversi ostacoli sia nella fase iniziale della coltura, con la scarsa reattività di alcuni espianti e/o di alcune varietà o con la persistenza di agenti inquinanti di difficile controllo, sia durante la fase di radicazione che, per molte varietà di carciofo, rappresenta il vero collo di bottiglia del procedimento. Infine, i diversi genotipi rispondono in maniera disforme alle differenti condizioni colturali. Una fase estremamente importante per la buona riuscita generale di tutto il processo consiste nell’ambientamento in serra delle piantine di carciofo micropropagate. Il successo di questa operazione dipende strettamente dalla qualità del materiale proveniente dalla coltura in vitro in quanto solo le piante ben sviluppate (3-4 cm in altezza) e con un apparato radicale adeguato (3-4 radici) hanno una buona probabilità di sopravvivenza in serra.

Prime applicazioni vivaistiche della coltura in vitro

La prima applicazione vivaistica delle colture in vitro risale ai primi anni ’80 con l’impiego di piante micropropagate di alcune selezioni di carciofo Romanesco da parte di due ditte, la Sais e la VitroPlant. La coltura in vitro ha avuto inizio con la moltiplicazione massiva del carduccio n. 3 (da qui il nome C3) prelevato in una carciofaia tradizionale da una pianta madre selezionata per la notevole precocità di produzione. Questo ha consentito di avviare l’applicazione su scala industriale della moltiplicazione in vitro del carciofo, aprendo la prospettiva concreta per un suo inserimento nella realtà agricola. Attualmente l’impiego di piante micropropagate è diventato una realtà soprattutto per la moltiplicazione di genotipi di carciofo primaverili, consentendo di modificare le tecnologie agronomiche tradizionalmente usate e offrendo la possibilità di clonare piante selezionate per alcuni caratteri quali la precocità. Prova ne è la realizzazione di cloni di carciofo Romanesco quali il C3, attualmente il più diffuso e coltivato, ma anche di altri di nuova costituzione come il Terom, il Tema 2000, l’Apollo, l’Exploter, il Grato 1 e il Grato 2. Con le piante micropropagate di carciofo è possibile oggi avere una carciofaia produttiva già dal primo anno dopo il trasferimento delle piantine in campo. I carciofi di tipo primaverile quali Terom, Apollo ed Exploter, micropropagati per diversi anni, risultano fenotipicamente stabili anche dopo centinaia di subcolture. Viceversa, il clone C3, selezionato per la precocità di produzione, essendo molto sensibile agli stress ambientali e agronomici, è talvolta soggetto a variazioni fenotipiche. Più complesse si sono rivelate le problematiche relative alla micropropagazione di genotipi rifiorenti di carciofo, coltivati prevalentemente nel Sud Italia e nelle isole, sia in relazione alle maggiori difficoltà nelle fasi di radicazione e acclimatamento, sia relativamente all’instabilità genetica delle piante micropropagate. Queste infatti, trasferite in campo, perdono spesso l’habitus morfo-fisiologico tipico dei genotipi rifiorenti e il carattere di precocità. Tale instabilità fenotipica, imputabile alla lunghezza del ciclo di moltiplicazione e alla dimensione dell’espianto, è stata osservata anche in altri genotipi rifiorenti come il Violetto di Provenza, il Brindisino e lo Spinoso sardo. Da qui la necessità di sviluppare adeguate metodologie di moltiplicazione (già sviluppate per alcuni cloni del germoplasma rifiorente) per la produzione di materiale di propagazione qualificato. Per queste tipologie, l’orientamento attuale è quello di utilizzare la coltura in vitro per la produzione di piante madri virus esenti da utilizzare poi per la propagazione con tecniche di moltiplicazione in vivo. Il diffondersi su ampie superfici di singoli cloni micropropagati, se da un lato rappresenta un indubbio vantaggio per il sistema produttivo, che può utilizzare materiale uniforme e quindi con precise caratteristiche organolettiche, morfologiche e produttive, determina nel tempo una drastica riduzione della variabilità genetica presente nelle popolazioni. Ciò comporta l’esigenza di identificare le popolazioni esistenti di carciofo per una loro caratterizzazione, valorizzazione e conservazione. Da qualche anno a questa parte è emersa la necessità di conservare le risorse genetiche e la biodiversità come pure quella di mantenere, a costi ragionevoli, il germoplasma vegetale in condizioni tali da assicurarne la stabilità genetica. Le tecniche di allevamento in vitro sono oggi usate, oltre che per la moltiplicazione, per aumentare la variabilità genetica e per conservare il germoplasma a breve/medio e a lungo termine (per es. crioconservazione).

Morfogenesi

La possibilità di rigenerare un individuo completo a partire da cellule e/o tessuti coltivati in vitro è spesso un requisito essenziale per le applicazioni biotecnologiche nelle piante. Questa capacità propria della cellula vegetale viene definita totipotenza ed è alla base dello sviluppo della tecnica della coltura di tessuto. Ogni tecnica di coltura in vitro inizia con l’asportazione di una porzione di pianta che si definisce espianto e che costituisce l’unità di base per l’avvio della coltura. Il processo che, partendo da cellule, tessuti e organi, porta alla formazione di una pianta completa prende il nome di morfogenesi. La morfogenesi in alcuni casi si realizza direttamente, a partire da cellule differenziate di un tessuto che vanno incontro a un processo di differenziamento e successivamente organizzano un germoglio, una radice o addirittura un embrione (somatico). Altre volte si ottiene la produzione di callo (un ammasso di cellule indifferenziate) dal quale successivamente si avvia il processo morfogenetico. La morfogenesi, pur essendo un processo che interessa tutte le specie vegetali, in alcuni casi (specie recalcitranti) si realizza con difficoltà, mentre in altri è spesso genotipo-dipendente. La risposta dell’espianto alla coltura viene influenzata da molteplici fattori quali lo stadio di sviluppo della pianta, l’organo da cui viene isolato l’espianto e la sua posizione sulla pianta madre, l’età del tessuto e il grado di differenziazione cellulare; per l’avvio di una coltura, diventa di primaria importanza la scelta dell’espianto più adeguato. Sul carciofo, falliti i diversi tentativi di ottenere rigenerazione da tessuti somatici utilizzando tessuti prelevati da germogli di carciofo micropropagati, sono state effettuate prove con tessuti (ipocotili, cotiledoni e internodi) derivati da “seme” e con brattee di capolini immaturi di circa 1-1,5 mm di lunghezza, prelevati in primavera da piante allevate in campo. I risultati hanno mostrato che il carciofo è da considerarsi una specie recalcitrante in vitro. Infatti, in materiale derivato da “semi”, l’induzione di rigenerazione avventizia è stata osservata solo in un caso. Risultati interessanti sono stati ottenuti in colture di brattee fiorali che, nel 27% dei casi, hanno originato germogli avventizi. In diverse specie, la rigenerazione di germogli è stata ottenuta anche a partire da protoplasti, cioè da cellule private della parete, per aggiunta nel terreno di coltura di una soluzione enzimatica (cellulasi, macerozima ecc.). Anche questa tecnica sul carciofo non è stata ancora messa a punto del tutto. Infatti, al momento, è possibile isolare protoplasti a partire da una sospensione cellulare, mantenerli vitali in coltura, stimolarne la divisione e la moltiplicazione fino all’ottenimento di calli, ma non è possibile rigenerare un germoglio. In conclusione, la morfogenesi in vitro non è ancora una tecnica utilizzabile per il carciofo, a causa della bassa efficienza di rigenerazione mostrata dal sistema, ma sarebbe molto utile per la sua applicazione nei programmi di miglioramento genetico.

Mutagenesi in vitro

L’impiego della mutagenesi, ovvero l’induzione di mutazioni mediante trattamenti con mutageni chimici o fisici, è particolarmente indicato nei programmi di miglioramento genetico nei casi in cui, partendo da una cultivar con caratteristiche ottimali, si vogliano apportare modifiche per uno o pochi caratteri della pianta, soprattutto se non presenti nel germoplasma naturale. Per specie a propagazione vegetativa, la combinazione delle tecniche di mutagenesi e di coltura in vitro rende più efficiente e rapido il processo di induzione e isolamento di mutanti a partire da cellule, tessuti o germogli, consentendo di operare su ampie popolazioni in breve tempo e in uno spazio limitato. L’uso di mutageni fisici, come i raggi gamma, viene generalmente preferito ai mutageni chimici, per efficienza di procedura, maggiore penetrabilità e più elevata frequenza di mutazioni.

Mutagenesi nel carciofo

Nel carciofo, la mutagenesi da sola, o applicata alla coltura in vitro, è stata poco utilizzata e i primi lavori risalgono rispettivamente agli anni ’60 e ’80. Successivamente, negli anni ’90, mediante trattamento con raggi gamma di germogli del clone C3 moltiplicati in vitro, sono stati isolati mutanti morfologici per lo sviluppo della pianta, per le dimensioni e il peso del capolino, per il colore verde o viola delle brattee, per la produttività; questi interessanti caratteri agronomici hanno però confermato solo in pochi casi la loro stabilità nelle generazioni successive. L’induzione di questi caratteri potrebbe rivelarsi utile per migliorare il clone Romanesco C3. La dose ottimale di 40 Gy è stata individuata come LD50 in base a una curva dose-effetto preliminarmente studiata.

Induzione di aploidi

Un metodo rapido per lo sviluppo di linee omozigoti, da utilizzare nei programmi di miglioramento genetico, è costituito dalla produzione in vitro di piante aploidi. La condizione aploide consente di ottenere linee isogeniche per caratteri recessivi interessanti da impiegare come parentali nella produzione di ibridi F1. Questa tecnica è fondamentale soprattutto in specie dioiche e autoincompatibili, ma anche in specie autogame per ridurre i tempi necessari al raggiungimento dell’omozigosi. Negli ultimi 30 anni, lo sviluppo dei metodi di induzione di piante aploidi ha subito un’enfasi enorme. La tecnica è stata applicata con successo in 247 specie tra cui per esempio Brassica, girasole, asparago, peperone, patata, tabacco e cereali. Come materiale di partenza sono generalmente utilizzate strutture gametiche a numero cromosomico aploide quali antere, microspore e ovari che, in opportune condizioni, possono modificare il loro indirizzo differenziativo dando origine a embriogenesi diretta o indiretta. Al momento non è stato ancora sviluppato nessun protocollo in grado di produrre piante aploidi di carciofo. I tentativi, basati sulla coltura di antere e ovari non fecondati, non hanno dato risultati incoraggianti che invece sono stati osservati, negli anni ’90, con la coltura delle microspore modificando un protocollo messo a punto per Brassica. Un aspetto positivo della coltura in vitro di microspore consiste nella differenziazione diretta dell’embrione rispetto a quella indiretta, dove prima si sviluppa il callo e poi l’embrione. Al momento è stata ottenuta una buona percentuale di induzione delle microspore seguita soltanto dalle prime divisioni cellulari. Dalle diverse esperienze condotte sinora, è emerso che, assieme allo stadio di sviluppo della microspora, il genotipo sembra svolgere un ruolo importante nell’induzione dell’embriogenesi. Bisogna comunque ottimizzare, per tutti i genotipi, le condizioni di induzione o di coltura in grado di assicurare l’ottenimento di aploidi.

Caratterizzazione molecolare

Il carciofo coltivato è rappresentato in Italia dal più ricco pool genico con gruppi varietali che si diversificano sulla base della morfologia del capolino (Spinoso, Violetto, Romanesco, Catanese). La scarsa conoscenza della biodiversità esistente all’interno del patrimonio locale ha determinato confusione sia nella terminologia sia nella classificazione del germoplasma disponibile. Infatti, generalmente questi ecotipi prendono il nome dalla località o dal paese dove sono coltivati con il risultato che ecotipi uguali portano nomi differenti o, al contrario, ecotipi differenti possono portare lo stesso nome. L’impiego di tecnologie molecolari fornisce un metodo rapido di identificazione precoce e contribuisce a ridurre omonimie e sinonimie che generano confusione nel riconoscimento dello stesso germoplasma. Come conseguenza, si trova un buon livello di discriminazione quando si vanno a paragonare accessioni appartenenti a tipologie differenti mentre, nell’analisi delle accessioni entro tipologia, spesso si riscontra una mancanza di corrispondenza fra distanze genetiche e origine geografica. Recentemente l’uso dei marcatori molecolari ha fornito lo strumento per poter valutare il germoplasma, considerando unicamente le varianti genetiche e non quelle ambientali che rendono il carciofo particolarmente plastico. Infatti i marcatori molecolari hanno numerosi vantaggi rispetto agli altri tipi di marcatori: non sono influenzati dall’ambiente, analizzano l’intero genoma, sono virtualmente infiniti, non hanno effetti pleiotropici o epistatici, possono essere codominanti, possono evidenziare anche polimorfismi che non producono varianti fenotipiche. La conoscenza della quantità e della distribuzione della variabilità genetica è essenziale per poter sviluppare strategie razionali, non solo per una corretta conservazione del germoplasma, ma anche per ottimizzare la sua utilizzazione. In questo quadro, l’analisi a livello del DNA fornisce uno strumento complementare all’uso dei tradizionali descrittori morfologici (UPOV) che, nel caso del carciofo, sono peraltro ancora in via di determinazione. Il lavoro in questo senso è però ancora parziale. I marcatori molecolari specifici per il carciofo sono pochi e, per molti di questi, non se ne conosce la localizzazione sul genoma. Al momento è stata pubblicata una sola mappa genetica che copre 1330 cM su circa 3000 cM e sono state effettuate caratterizzazioni molecolari di germoplasma di carciofo (tipologie Romanesco, Spinoso sardo, Violetto di Sicilia, Catanese, Spinoso di Palermo) e di cardo sia selvatico sia coltivato. Un esempio di utilizzazione dell’analisi molecolare per identificare e caratterizzare il germoplasma di carciofo è quello condotto sulla tipologia Romanesco coltivata nel Lazio, dove sono presenti principalmente due ecotipi tradizionali: il Castellammare e il Campagnano, che differiscono per l’epoca di produzione dei capolini. Inoltre, la cinaricoltura del Lazio ha visto l’enorme espansione del clone C3 che, grazie alla propagazione in vitro e alla sua notevole precocità, ha rimpiazzato molto del materiale autoctono laziale. Questo ha comportato una conseguente erosione genetica e perdita di germoplasma autoctono, ponendo la cinaricoltura laziale a rischio di vulnerabilità da stress biotici e abiotici. Mediante l’utilizzazione di marcatori molecolari di tipo ISSR e AFLP, è stato possibile identificare dei fingerprinting genetici per 19 cloni di carciofo Romanesco. I marcatori utilizzati (soprattutto quelli della tipologia AFLP) hanno identificato alcune bande presenti in un solo genotipo e quindi capaci di discriminarlo fra gli altri. La presenza di bande private è comune anche ad altre collezioni di carciofo analizzate con marcatori molecolari. In accordo con le loro distanze genetiche, i cloni analizzati possono essere suddivisi in due gruppi principali, ciascuno dei quali include nove dei 19 cloni analizzati; solo un clone è risultato separato da tutti gli altri. Non è stata rilevata alcuna correlazione fra la matrice basata sulle distanze genetiche e quella basata sui caratteri morfologici [Mantel test (r2=0,0023 n.s.)], sottolineando l’estrema plasticità fenotipica di questa specie e quindi l’importanza di caratterizzare il materiale genetico per tratti non influenzati dall’ambiente. La caratterizzazione molecolare può essere utile anche per riconoscere e proteggere prodotti tipici con marchi di denominazione controllata. Può inoltre essere usata per la selezione assistita nel miglioramento genetico. Quest’ultima utilizzazione nel carciofo è ancora ai primi stadi di applicazione, sebbene alcuni studi abbiano rilevato l’esistenza di associazioni interessanti fra marcatori e caratteri morfo-fisiologici d’interesse (per es. epoca di comparsa e dimensione del capolino). Queste associazioni sono al momento basate solo su alcune correlazioni che vanno tuttavia verificate nel tempo, in diversi ambienti e su un ampio spettro di tipologie di carciofo.

 


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