Volume: le insalate

Sezione: utilizzazione

Capitolo: aspetti microbiologici delle insalate

Autori: Fausto Gardini, Rosalba Lanciotti

Introduzione

Tutte le manipolazioni cui vanno incontro i vegetali prelevati dai campi sono necessariamente destinate a velocizzare l’aggressione dei loro tessuti da parte dei microrganismi. Le piante posseggono numerosi meccanismi di difesa per proteggersi dall’aggressività di queste microscopiche forme di vita; esse tuttavia cominciano già a essere intaccate dalla prima operazione necessaria per la loro utilizzazione a scopo alimentare, vale a dire la raccolta. Infatti, questa operazione è di per sé causa di alterazioni fisiologiche che riducono la capacità di mantenere l’omeostasi, di limitare i danni da traumi e, in ultima analisi, di ridurre le alterazioni causate dalla crescita di microrganismi saprofiti. Già la conservazione post-raccolta ha come obiettivo quello di diminuire o ritardare le perdite qualitative causate da questa operazione. Le operazioni unitarie poste in atto nelle fasi successive per l’ottenimento di prodotti di quarta gamma inevitabilmente aggravano questo stato di sofferenza dei tessuti vegetali aggiungendo ulteriori stress (soprattutto quando siano previste operazioni di taglio), che devono essere, per quanto possibile, controbilanciati da accorgimenti che ostacolino la proliferazione e l’attività dei microrganismi naturalmente presenti. La popolazione microbica che contribuisce al decadimento qualitativo dei prodotti di quarta gamma è il risultato della sommatoria (non algebrica) di diverse componenti. La prima è sicuramente costituita dalla flora microbica di campo, che peraltro può comprendere anche specie che vivono simbioticamente con i vegetali, la cui composizione dipende da vari fattori, tra i quali spiccano i fattori agronomici, ambientali e quelli legati alla specificità del vegetale. A questi si aggiungono poi i microrganismi acquisiti durante le fasi di stoccaggio e soprattutto di processo, derivanti sia dalla contaminazione incrociata con gli ambienti, sia dall’apporto antropico. All’interno di questo potenzialmente enorme bacino microbico, le condizioni imposte durante la produzione e la conservazione selezionano quelle specie e quei ceppi che saranno poi in grado di moltiplicarsi o di sopravvivere nell’alimento finito durante la conservazione e che quindi arriveranno al consumatore. Questi microrganismi possono assumere il duplice aspetto di microrganismi degradativi, vale a dire tali da alterare le qualità organolettiche del prodotto fino a renderlo non idoneo per il consumo, e microrganismi patogeni o tossigeni, la cui presenza può determinare nel consumatore tossinfezioni alimentari e patologie più o meno gravi.

Carica microbica della materia prima

Contaminazione di campo
Durante la permanenza in campo i vegetali, soprattutto se a contatto con il suolo, si contaminano con i diversi microrganismi che sono presenti in gran numero nel terreno. La composizione della popolazione microbica del suolo dipende da diversi fattori, tra i quali i principali sono: – le pratiche agronomiche, in primo luogo le concimazioni, soprattutto se organiche, e l’irrigazione, non tanto per la quantità quanto piuttosto per la qualità delle acque utilizzate; – le variabili meteorologiche (temperature e regime pluviale) e ambientali, come la contiguità con ambienti che possono influire sulla comunità microbica, la presenza di allevamenti, attività industriali ecc. Inoltre, un ruolo importante viene svolto dal tipo stesso di vegetale, a causa dei diversi tipi di meccanismi di difesa delle piante dalle flore microbiche saprofite presenti nel suolo. Spesso le indagini condotte quantitativamente si soffermano sulla flora mesofila aerobia totale e sui coliformi, considerati indice di contaminazione fecale. Il primo parametro non rende conto della componente qualitativa della popolazione microbica. Quest’ultima di solito risulta composta prevalentemente da popolazioni Gram-negative aerobie, genericamente riconducibili alle Pseudomonadaceae (con variazioni però estremamente significative). Sono presenti inoltre batteri corineformi, funghi (muffe e lieviti) e batteri lattici, oltre a numerose specie saprofitiche e commensali; queste ultime tendono a scomparire in modo rapido proporzionalmente all’entità degli interventi tecnologici applicati durante il processo di trasformazione. Per quanto riguarda i coliformi, la loro concentrazione viene storicamente considerata un indice indiretto di contaminazioni fecali. Tuttavia, non poche critiche sono state sollevate circa il significato di questo parametro, e non solo riguardanti i vegetali. Nel caso specifico è stato per esempio fatto notare che la presenza di batteri appartenenti ad alcune specie di Enterobacter è da considerarsi normale su molti vegetali a foglia e non dunque sintomo di pratiche scorrette. Queste indicazioni sono peraltro già parzialmente recepite nelle normative comunitarie, dove viene prescritto un limite massimo non già per i coliformi in generale, ma per l’Escherichia coli. Per quanto concerne l’entità numerica della carica microbica iniziale, i dati disponibili in letteratura sono caratterizzati da ampia variabilità. Infatti, i livelli di carico rilevati variano tra 103 e 106 cfu/g di prodotto. È comunque noto che la carica microbica tende a diminuire passando dalle foglie esterne verso il cuore del prodotto e che questa diminuzione può anche essere di numerosi cicli logaritmici. Come già detto, la frazione della popolazione microbica proveniente dal campo è decisamente importante. Tra i fattori più rilevanti che intervengono a influenzare quantitativamente e qualitativamente questo parametro si possono citare senza dubbio le modalità di concimazione, soprattutto se vengono utilizzati concimi organici. Infatti, questi materiali sono stati spesso riconosciuti come il serbatoio di batteri patogeni di provenienza tipicamente animale (Salmonella, Escherichia coli O157). In questo senso anche la libera circolazione degli animali allevati allo stato brado o di quelli domestici nei campi destinati alla coltivazione delle materie prime può contribuire alla loro contaminazione con microrganismi pericolosi per la salute. Problematiche analoghe (e talvolta correlate) possono derivare dal tipo di acque utilizzate per l’irrigazione. Naturalmente l’impiego di acque reflue aumenta la possibilità di contaminazione da parte di specie pericolose (le stesse presenti nei letami), soprattutto se l’irrigazione ha luogo poco prima della raccolta. Anche l’andamento meteorologico influisce sulla composizione della flora microbica: per esempio, climi caldi e siccitosi sembrano ridurre l’incidenza di batteri lattici nella microflora a scapito di altre specie più deleterie per la shelf-life del prodotto. La microflora della rizosfera in genere è molto diversa rispetto a quella che si trova sulle foglie (può presentare anche microrganismi anaerobi, come i clostridi, ed è particolarmente ricca di spore fungine). Questa può contaminare il prodotto al momento della lavorazione quando sia prevista la raccolta della radice o di parte di essa o anche semplicemente attraverso il terriccio presente come impurità. Anche l’utilizzo di agrofarmaci è in grado di influenzare la composizione della microflora poiché molte di queste molecole risultano inibenti per certi gruppi microbici e non per altri. Infine, non deve essere sottovalutato l’apporto antropico alla contaminazione durante le fasi di raccolta e di movimentazione delle materie prime. Eventuali operazioni di lavaggio dei prodotti dopo la raccolta hanno indubbiamente lo scopo di allontanare il più possibile i residui terrosi (i lavaggi possono essere ripetuti per vegetali particolarmente sporchi), ma, se ben condotti, possono anche provvedere all’allontanamento di una parte dei microrganismi presenti sulle foglie (fino a 1-2 cicli logaritmici per grammo di prodotto). Infine non deve essere sottovalutata la qualità della materia prima: l’impiego di materia prima con traumi o attaccata da insetti favorisce la proliferazione di specie batteriche con spiccate attitudini degradative, in grado di ridurre significativamente la shelf-life dei prodotti. Infatti, piante integre possono essere attaccate solo da microrganismi fitopatogeni il cui significato sul prodotto finito è molto limitato. La presenza di parti intaccate e l’incrementata disponibilità di nutrienti determinata dalla fuoriuscita di succhi cellulari consentono invece a molti più microrganismi la colonizzazione dei tessuti vegetali.

Contaminazione durante lo stoccaggio
Il periodo di stoccaggio prima della lavorazione interviene a modificare la composizione quali-quantitativa della comunità microbica non tanto, o non solo, per la contaminazione ambientale (magazzini, imballaggi, mezzi di trasporto, ulteriori manipolazioni), quanto piuttosto per le modificazioni indotte dalle temperature adottate (per es. refrigerazione) che favoriranno alcuni gruppi microbici piuttosto che altri. Infatti i microrganismi possono essere notoriamente suddivisi, sulla base delle temperature ottimali e minime per lo sviluppo, in termofili, mesofili, psicrofili e psicrotrofi. Tra questi ultimi troviamo molti agenti degradativi dei prodotti alimentari frigoconservati in quanto, pur avendo temperature ottimali di sviluppo simili a quelle dei mesofili (30-37 °C), sono caratterizzati da temperature minime di moltiplicazione prossime a 0 °C. Anche molti microrganismi patogeni appartengono agli psicrotrofi e possono svilupparsi nei prodotti di quarta gamma refrigerati. Ovviamente la selezione operata dalla refrigerazione dipenderà dalle temperature utilizzate, dalle eventuali oscillazioni termiche nonché dal tempo di stoccaggio.

Contaminazione durante le lavorazioni

La fase di lavorazione vera e propria delle materie prime che prelude al confezionamento e all’immissione del prodotto sul mercato determina una significativa variazione quali-quantitativa della popolazione microbica. Questi cambiamenti sono il risultato di due fattori. Da un lato, la presenza di microrganismi veicolati dalle materie prime viene sostanzialmente ridotta in seguito alle operazioni di lavaggio cui vanno incontro; al tempo stesso la popolazione microbica, che poteva essere anche molto differente per numero e composizione tra pianta e pianta, viene omogeneizzata in tutta la massa trattata. Dall’altro, nuovi contaminanti microbici possono finire nel prodotto a causa del contatto delle materie prime e dei prodotti con quella che viene definita “flora di stabilimento”, cioè la popolazione microbica che colonizza gli stabilimenti di produzione dell’industria alimentare; quest’ultima componente, a causa della selezione che ha dovuto superare per potere insediarsi nelle aree produttive, risulta essere solitamente piuttosto resistente alle condizioni di stress che si verificano durante la produzione e i processi di sanificazione. In altre parole, quindi, non è affatto detto che le specie microbiche presenti nella materia prima siano poi quelle che determinano la degradazione del prodotto confezionato definendone la shelf-life. L’eliminazione delle foglie esterne comporta di per sé la riduzione della carica totale, soprattutto in prodotti come l’indivia, in quanto, come già riportato, in molti prodotti il numero di microrganismi diminuisce anche drasticamente passando dall’esterno verso l’interno. Va da sé che questo processo di ripulitura va condotto con attenzione per non ricontaminare gli strati più interni che vengono scoperti. Le operazioni di taglio influenzano decisamente l’ambiente da un punto di vista microbico poiché, lacerando le cellule vegetali, rilasciano succhi cellulari che costituiscono un nutrimento facilmente disponibile per i microrganismi presenti. Dunque, quanto più saranno estese le operazioni di taglio, tanto più sarà favorita la crescita microbica. In questo senso insalate confezionate a foglia intera saranno meno esposte alla proliferazione microbica delle insalate pretagliate. È anche stato dimostrato, mediante studi al microscopio elettronico condotti su ortaggi a foglia intera (spinaci), che i batteri erano concentrati nel gambo del vegetale e nelle zone in cui le foglie avevano subito traumi meccanici anche di scarsa entità. Anche il tipo di taglio (quindi le strumentazioni utilizzate) è importante poiché maggiore è la lacerazione indotta, maggiore sarà la possibilità di sviluppo microbico. È stato dimostrato che la carica microbica totale aumenta rapidamente di 100 volte in seguito alle operazioni di taglio. Gli impianti e le strumentazioni utilizzati per il processo devono naturalmente essere mantenuti puliti e sanificati allo scopo se non di eliminare, almeno di ridurre la possibilità di formazioni di microcolonie e biofilm. Infatti, la presenza di biofilm riduce notoriamente l’efficacia di agenti sanitizzanti sia chimici sia fisici, incrementando conseguentemente le sorgenti di contaminazione microbica. Ovviamente, molta attenzione deve anche essere posta nelle pratiche igieniche dei dipendenti.

Lavaggi
Per quanto concerne invece la fase critica del lavaggio, è stato dimostrato che l’utilizzo di acqua senza additivi può comportare al massimo l’abbattimento di un ciclo logaritmico dei microrganismi presenti inizialmente. L’uso di acque clorate (100-200 mg/l) in questo senso è più soddisfacente; tuttavia, queste sono inefficaci nel disattivare cellule microbiche adese alle superfici. La temperatura delle acque di lavaggio è ovviamente centrale per il controllo della carica microbica. Da segnalare la possibilità di introdurre in fase di lavaggio uno shock termico (45-60 °C per pochi minuti, variabili a seconda del tipo di vegetale) che avrebbe effetti positivi, oltre che sulla riduzione del carico microbico, sulle reazioni che portano all’imbrunimento enzimatico e ad altre reazioni fisiologiche negative dei tessuti vegetali. Questa tecnica è stata sperimentata su vegetali come lattuga, sedano e cicoria. Sono tuttavia segnalati casi in cui, a fronte di un miglioramento della qualità del vegetale nei primi giorni di conservazione, ha luogo un più rapido deperimento nella seconda fase della conservazione. Indipendentemente dalla strategia utilizzata, questo processo di decontaminazione “chimica” richiede il contatto tra il microrganismo e la molecola antimicrobica; questo contatto può essere reso più difficile dalla presenza di tagli o traumi sulla pianta, che permettono ai microrganismi di rifugiarsi all’interno del prodotto procurandosi in tal modo un importante effetto protettivo. Altre tecniche di disinfezione, che prescindono dall’uso di composti a base di cloro, hanno dato risultati a volte contraddittori. L’uso di perossido di idrogeno o acque elettrolizzate, per esempio, talvolta hanno dato risultati positivi per pochissimi giorni, ma poi la qualità del prodotto è scaduta più rapidamente rispetto al testimone trattato in modo tradizionale, probabilmente a causa di effetti dei trattamenti sulle cellule vegetali che le rendono più esposte agli attacchi da parte dei microrganismi. L’utilizzo di oli essenziali per la conservazione di prodotti vegetali interi (in particolare frutta) è già stato studiato con successo. Nel caso della frutta di quarta gamma, ottimi risultati sono stati ottenuti aggiungendo alle acque di lavaggio oli essenziali o loro componenti ad attività antimicrobica. Questa strategia si presenta estremamente interessante anche per il trattamento delle insalate. Per esempio, l’uso di olio essenziale di timo ha dato buoni risultati nella trattamento di lattuga contaminata con Escherichia coli O157. Buoni risultati su Listeria monocytogenes sono stati ottenuti utilizzando oli di rosmarino, origano e timo. L’uso di ozono o di acque ozonizzate (3-5 ppm) in insalate tagliate di quarta gamma ha dato risultati decisamente contrastanti nel controllo della microflora patogena e i dati riportati variano da nessun effetto ad abbattimenti di oltre 4 cicli logaritmici. Questa enorme fluttuazione va probabilmente ascritta alle caratteristiche e alla variabilità delle materie prima utilizzate nei diversi studi. Inoltre, i quantitativi di ozono devono essere tenuti sotto controllo per i danni che livelli al di sopra di certi valori possono causare alle cellule vegetali. Attualmente non ne è consentito l’uso in Europa. Buoni risultati sono stati osservati quando all’acqua di lavaggio venivano aggiunti (1-2%) acidi organici (acetico, lattico e citrico), ma il loro utilizzo è spesso limitato dall’impatto organolettico, oltre che dai problemi connessi con il trattamento delle acque reflue (alti COD). L’acido peracetico, utilizzato nei limiti previsti dalla legislazione statunitense (in Europa non è ammesso), ha invece portato a scarsi risultati. Alcuni studi pongono infine l’accento sul rischio di un eccessivo abbattimento della carica microbica del prodotto al momento del confezionamento. Questa osservazione, apparentemente paradossale, è basata su due aspetti. Anzitutto, una bassa carica microbica iniziale comporterebbe un prolungamento della shelf-life ma darebbe anche a eventuali microrganismi patogeni più tempo per la moltiplicazione e quindi maggiore possibilità di raggiungere concentrazioni infettive. Inoltre, la diminuzione della flora competitiva conferirebbe a eventuali patogeni sopravvissuti o presenti maggiori chance di colonizzazione del prodotto. Si tratta di due considerazioni importanti da tenere bene a mente in ogni modificazione del processo che comporti una maggiore efficacia nell’abbattimento microbico della materia prima.

Effetto della temperatura
Il controllo della temperatura è essenziale per il controllo della crescita microbica. L’applicazione di basse temperature rallenta le cinetiche di crescita dei microrganismi e in certi casi può completamente inibirne lo sviluppo. Il controllo della temperatura durante lo stoccaggio (refrigerazione) e il mantenimento di basse temperature negli ambienti e nelle acque di lavaggio sono perciò di estrema importanza. L’applicazione delle basse temperature favorisce quindi le specie con maggiori attitudini alla crescita in queste condizioni, come le Pseudomonadaceae. In ogni caso, differenze di pochi gradi nelle condizioni operative (e successivamente durante la conservazione) possono determinare uno sviluppo microbico estremamente diverso da un punto di vista sia quantitativo sia della composizione delle popolazioni microbiche. La temperatura e le oscillazioni termiche hanno una grande importanza anche per la sopravvivenza o lo sviluppo dei batteri patogeni (di cui parleremo più dettagliatamente in un paragrafo successivo). Tra questi Listeria monocytogenes è la specie con maggiori attitudini a crescere a basse temperatura; tuttavia, sviluppi molto limitati o assenti per questa specie sono stati evidenziati in cicoria e lattuga mantenute a 5-8 °C. Più importante invece è risultata, alle stesse condizioni, la crescita di Aeromonas hydrophila. Per quanto concerne gli enterobatteri patogeni, e più specificatamente Salmonella ed Escherichia coli O157, lo sviluppo è stato riscontrato solo in condizioni di abuso termico (sostanzialmente temperature di 10 °C o superiori). Si tenga peraltro ben presente che le stesse specie, pur non potendo moltiplicarsi, non vengono rapidamente uccise dallo stoccaggio a queste temperature.

Effetto del pH
È noto come il pH sia uno dei principali fattori che regolano la crescita dei microrganismi e che quanto più il pH si muove dalla neutralità verso valori acidi, tanto più diminuisce il numero delle specie microbiche in grado di svilupparsi e/o si riduce la velocità di moltiplicazione. Nel caso in questione, il valore del pH dipende essenzialmente dalla tipologia del vegetale utilizzato. Esistono infatti vegetali con reazione marcatamente acida (come i pomodori), mentre le lattughe hanno una reazione prossima alla neutralità. Il pH del vegetale non è facilmente correggibile nei prodotti di quarta gamma di cui stiamo parlando, a meno che i vegetali a foglia non siano ingredienti di insalate più complesse pronte all’uso; in questo caso, un certo controllo dell’acidità può essere perseguito tramite l’uso di opportuni condimenti.

Confezionamento
L’ultimo ostacolo che si può opporre alla proliferazione microbica all’atto del confezionamento è l’utilizzo di atmosfere modificate impoverite di ossigeno e arricchite in anidride carbonica. In realtà anche nei prodotti confezionati in atmosfera ordinaria, a causa dell’attività respiratoria dei tessuti vegetali, l’ossigeno presente viene rapidamente consumato con concomitante accumulo di anidride carbonica, creando un ambiente anossico; in questo caso si parla anche di atmosfera modificata passiva. L’assenza di ossigeno rende impossibile lo sviluppo delle specie strettamente aerobie (come le Pseudomonadaceae), ma consente, e può addirittura favorire, le specie in grado di crescere in assenza di ossigeno; tra queste ultime possiamo annoverare le Enterobacteriaceae, alcuni funghi, principalmente lieviti, e i batteri lattici. L’assenza di ossigeno non limita le possibilità di crescita di Listeria monocytogenes, che risulta addirittura favorita nello sviluppo da concentrazioni di anidride carbonica particolarmente elevate (nell’ordine del 50%).

Condizioni di trasporto e di vendita

Naturalmente la qualità dei prodotti deve essere mantenuta anche durante il trasporto e la permanenza sugli scaffali al dettaglio. A tal fine è di fondamentale importanza il mantenimento della catena del freddo e più specificamente, durante le fasi di trasporto e di vendita, devono essere assicurate temperature minori o uguali a 5 °C. Le temperature nelle diverse fasi devono essere monitorate nel modo più preciso possibile, dal momento che oscillazioni termiche anche di pochi gradi possono avere enormi ripercussioni sulla velocità di sviluppo di microrganismi sia patogeni sia degradativi. Al fine di salvaguardare la qualità dei prodotti fino al consumo, nonché di prevenire le tossinfezioni alimentari, è estremamente importante anche la corretta informazione del consumatore. Quest’ultimo deve essere reso edotto, attraverso una corretta ed esaustiva etichettatura, sull’estrema deperibilità del prodotto e sulla necessità di provvedere a una tempestiva ripresa della catena del freddo dopo l’acquisto.

Degradazione microbica dei prodotti di quarta gamma

La degradazione delle insalate di quarta gamma è il risultato della moltiplicazione della popolazione microbica inizialmente presente fino a una concentrazione tale da determinare modificazioni organolettiche percettibili (presenza di odori o sapori sgradevoli, formazione di patine viscide, di decolorazioni ecc.) che rendono non più commerciabile il prodotto. Questa soglia può genericamente essere posta al di sopra di 107 (7,0 log ufc) cellule microbiche per grammo di prodotto. In realtà questa generalizzazione deve essere presa come tale, cioè soggetta a numerose eccezioni. Infatti, occorre tenere presente che esistono specie con elevato potenziale degradativo la cui presenza viene percepita a concentrazioni più basse, mentre alcuni batteri lattici possono avere impatti organolettici molto ridotti anche ad alte concentrazioni (e, anche per questo, sono utilizzati come colture protettive). Quel che è certo è che le comunità microbiche che alterano i vegetali di quarta gamma sono diverse da quelle che alterano gli stessi vegetali non trasformati. La maggior parte dei produttori basano le previsioni di shelf-life sui valori del conteggio microbico totale o di gruppi microbici specifici e sull’osservazione dei difetti associati alla crescita, come la degradazione enzimatica dei tessuti vegetali. Fondamentalmente le alterazioni che compaiono durante la conservazione sono costituite da imbrunimenti, produzione di odori sgradevoli, difetti di texture e marcescenza.

Microrganismi degradativi
I microrganismi maggiormente presenti nelle insalate di quarta gamma al momento del confezionamento sono batteri Gram-positivi aerobi con attitudini proteolitiche, lipolitiche e pectinolitiche riconducibili alla famiglia Pseudomonadaceae, compresi i generi Xanthomonas, Flavobacterium, Chromobacterium e Alcaligenes. Sempre presenti già in campo si possono citare i batteri corineformi e i batteri lattici; tra questi ultimi sono stati isolati prevalentemente specie appartenenti ai generi Lactobacillus, Pediococcus e Leuconostoc. La loro incidenza è maggiore e la loro attività più importante nei prodotti a base di frutta piuttosto che nei vegetali. Tuttavia, anch’essi possono contribuire ai processi degradativi, anche se caratterizzati da attività enzimatiche meno spiccate rispetto alle Pseudomonas. Si tratta di specie che non necessitano di ossigeno per la moltiplicazione essendo caratterizzate da un metabolismo esclusivamente fermentativo; la loro crescita determina essenzialmente acidificazione ed eventualmente, in funzione della specie, la comparsa di odore di aceto o di burro. Dal canto loro, i batteri corineformi sono un vasto ed eterogeneo gruppo di batteri Gram-positivi; perlopiù si tratta di batteri aerobi e molti producono pigmenti. Nei vegetali di quarta gamma sono state isolate specie riconducibili ai generi Arthrobacter, Rhodococcus e Brevibacterium. In particolare Arthrobacter è ben presente nel suolo, nella rizosfera e quindi anche nei vegetali a foglia coltivati. I microrganismi di questo genere, pur non essendo pectolitici, possono degradare altri composti polimerici. Inoltre producono polifenolo ossidasi e anche composti solforati a forte (e sgradevole) impatto organolettico, come il metantiolo. Anche le Enterobacteriaceae si possono riscontrare in elevate concentrazioni già nella materia prima e in particolare le specie più diffuse sono Enterobacter cloacae, Pantoea agglomerans e Rhanella aquatilis. Il genere Erwinia raccoglie specie patogene per molte piante in campo; comunque, anche quando presenti in grandi quantità sulla materia prima, queste specie non partecipano ai fenomeni degradativi sul prodotto finito. Sono Enterobacteriaceae i coliformi (questi sono enterobatteri in grado di fermentare il lattosio) come anche molte specie potenzialmente patogene appartenenti ai generi Salmonella, Yersinia enterocolitica, Shigella somnei, nonché i ceppi verocitotossici di Escherichia coli (vedi paragrafo relativo). Sono specie anaerobie facoltative, quindi si moltiplicano respirando in presenza di ossigeno o fermentando in sua assenza, e non sono quindi inibite dalla presenza di atmosfere modificate. In entrambi i casi producono odori e sapori sgradevoli. L’effetto dei funghi (lieviti e muffe) sulla shelf-life dei prodotti di quarta gamma è secondario rispetto all’azione dei batteri, salvo che la materia prima non abbia caratteristiche di elevata acidità (non è il caso dei vegetali a foglia ma è, per esempio, il caso del pomodoro) o il prodotto non sia addizionato di condimenti acidi (aceto, maionese ecc.).

Microrganismi patogeni potenzialmente presenti nelle insalate di quarta gamma

Parallelamente all’incremento nella diffusione sul mercato delle insalate di quarta gamma, sono aumentate anche le segnalazioni di epidemie di natura microbica associate al consumo di questi prodotti. Le principali patologie sono causate da agenti batterici e virali e in alcuni casi hanno assunto dimensioni molto consistenti: il caso più eclatante riportato ha interessato all’incirca 10.000 persone infettate con Escherichia coli O157 in Giappone dopo il consumo di germogli di ravanello. I microrganismi patogeni coinvolti con maggiore frequenza in tossinfezioni alimentari determinate da prodotti vegetali di quarta gamma sono indubbiamente Listeria monocytogenes, Escherichia coli VTEC e Salmonella spp. Tuttavia, anche altri microrganismi patogeni vengono frequentemente isolati in questa tipologia di prodotti. Sono state inoltre segnalate importanti tossinfezioni causate dalla presenza di virus, in particolare Norovirus e virus dell’epatite A.

Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes è tra le maggiori cause di tossinfezioni alimentari dovute al consumo di prodotti quali formaggi, carni di vario tipo e piatti pronti. Anche i prodotti vegetali sono stati coinvolti in epidemie causate da questo patogeno. Già nel 1985 un’epidemia di listeriosi fu imputata al consumo di cavolo cappuccio affettato; la fonte fu individuata nel letame usato per le concimazioni in campo.

Escherichia coli
Generalmente nei prodotti di quarta gamma viene valutata la presenza di un solo sierotipo enteroemorragico, Escherichia coli O157:H7, sebbene altri sierotipi, quali O111:NM, O26:H11 e O26:HNM, siano spesso causa di patologie. Va inoltre ricordato il recentissimo caso che ha interessato la Germania legato alla presenza di Escherichia Coli 0104 in semi germogliati per il consumo umano (vedi box di riferimento). Tuttavia, sono poche le evidenze sperimentali che documentano l’incidenza di questi sierotipi negli alimenti e praticamente sono assenti dati relativi alla loro frequenza nei prodotti di quarta gamma. Escherichia coli O157 è stato isolato per la prima volta verso la metà degli anni ’70 e la sua diffusione è legata ai prodotti di origine animale, in particolare ai bovini. Nelle insalate di quarta gamma la presenza di questo batterio può quindi dipendere da contaminazioni antropiche durante la lavorazione e, soprattutto, da pratiche di concimazione organica o dall’uso di acque di irrigazione contaminate. Inoltre, la produzione di insalate miste contenenti anche ingredienti di origine animale (carni, latticini) può aumentare il rischio legato a questo microrganismo. Dal 1995 negli Stati Uniti sono state segnalate almeno 22 epidemie di Escherichia coli O:157 determinate dal consumo di insalate e spinaci. Una matrice particolarmente sensibile è quella dei semi germogliati, di cui è stata già ricordata l’esperienza giapponese e tedesca. Una recente indagine ha mostrato che un’elevata quantità (circa l’1,5%) di semi destinati alla germogliazione per il consumo umano conteneva cariche troppo elevate di Escherichia coli. Le indicazioni delle agenzie governative pongono l’accento più sulla prevenzione di questo batterio che sulla sua rimozione attraverso le pratiche produttive. Infatti, molti studi hanno dimostrato che le operazioni di lavaggio (condotte usando diversi sanificanti) prima del taglio e del confezionamento rimuovono una quantità limitata di questo microrganismo, soprattutto in rapporto alla bassissima soglia di infettività che lo contraddistingue. È stato addirittura dimostrato che le operazioni di lavaggio condotte sulle materie prime dopo la raccolta in campo possono essere causa di diffusione e contaminazione incrociata di Escherichia coli O157:H7.

Salmonella
Nell’ambito del genere Salmonella la differenziazione viene effettuata sulla base delle caratteristiche antigeniche, ossia degli antigeni di parete (antigeni O), degli antigeni flagellari (antigeni H) e degli antigeni di superficie. Sono attualmente noti più di 2500 sierotipi, dei quali tuttavia solo 200 sono patogeni per l’uomo: tra questi ricordiamo Salmonella typhi, che è l’agente causale delle febbre tifoide. I sierotipi non tifoidi causano generalmente gastroenteriti ed enterocoliti 8-72 ore dopo l’ingestione dell’alimento contaminato. Le salmonelle vengono isolate di frequente dalle materie prime; infatti, frutta e vegetali sono stati identificati come frequenti veicoli di salmonellosi. In particolare spinaci, lattuga, cipolla verde, melone e fragole sono stati frequentemente implicati in tossinfezioni alimentari causate da Salmonella spp. Le materie prime vegetali possono essere infatti contaminate da questo microrganismo tramite irrigazione con acque inquinate, concimazioni organiche o operatori infetti. Tuttavia, sono piuttosto rari i casi di salmonellosi associati al consumo di prodotti di quarta gamma; questi sono stati tutti attribuiti al consumo di germogli di alfalfa come tali o come ingredienti di prodotti misti confezionati. D’altra parte le salmonelle, non essendo microrganismi psicrotrofi, non sono in grado di moltiplicarsi a temperature inferiori a 5-7 °C. Questi microrganismi pertanto non costituiscono un rischio nei prodotti di quarta gamma se viene correttamente applicata e mantenuta la catena del freddo, a meno che la contaminazione iniziale sia elevatissima. Tra i vegetali di quarta gamma trovati contaminati da Salmonella si possono citare germogli, lattuga, spinaci, cavoli, pomodori, ma anche frutti come il melone e le fragole. In ogni caso, vere e proprie tossinfezioni dovute a questo agente sono state segnalate in seguito al consumo di semi di alfalfa. Come Escherichia coli, anche Salmonella ha come habitat vocato gli animali a sangue caldo, quindi la sua presenza è dipendente da contaminazioni di origine prevalentemente fecale (acque di irrigazione, concimazioni). Diverse recenti indagini estensive condotte su vegetali di quarta gamma in diverse aree hanno messo in luce la presenza di Salmonella in quantità variabili tra lo 0,2% e l’1% dei campioni analizzati.

Shigella Il genere Shigella è strettamente legato a Escherichia coli, di cui condivide molte caratteristiche. Il genere è suddiviso in quattro specie, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Shigella flexneri e Shigella boydii, agenti di shigellosi o dissenteria bacillare nell’uomo. I serovar invasivi di Shigella dysenteriae producono una tossina citotossica nota come tossina Shiga. Al contrario, i ceppi non invasivi di Shigella dysenteriae, unitamente a quelli delle altre specie del genere, evidenziano bassi livelli di citotossicità associati ad attività endotossica e neurotossica. I casi di shigellosi sono generalmente associati al consumo di acqua o alimenti contaminati da materiale fecale umano; ne consegue che questi microrganismi possono essere veicolati sulle materie prime da acque di irrigazione contaminate, fertilizzanti organici e insetti. Tuttavia, anche l’uomo è un importante vettore di Shigella spp. I dati della letteratura internazionale riportano almeno 7 casi di shigellosi dovuti al consumo di prodotti vegetali di quarta gamma. Le specie del genere possono sopravvivere a lungo (fino a 3-4 giorni) in lattuga tagliata refrigerata.

Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus è stato frequentemente isolato da vegetali freschi e prodotti di quarta gamma, ma non ci sono segnalazioni di tossinfezioni stafilococciche causate da tali prodotti. Questo cocco Gram-positivo viene generalmente veicolato durante la lavorazione dagli operatori, essendo generalmente presente nelle prime vie aree e sulla pelle dell’uomo. La tossicità di questo batterio dipende dalla produzione di tossine che ha luogo quando la sua concentrazione supera certi livelli (105-106 cellule per grammo). Tuttavia è noto che Staphylococcus aureus ha habitat vocati diversi dai vegetali e che quindi, nei vegetali freschi e di quarta gamma, non è competitivo con la microflora naturalmente presente.

Campylobacter jejuni
Campylobacter jejuni è un microrganismo Gram-positivo a forma di bastoncino ricurvo microaerofilo. Si tratta di un comune contaminante del tratto intestinale di animali domestici e non. È l’agente causale di enteriti associate generalmente al consumo di alimenti di origine animale. I sintomi della tossinfezione consistono in diarrea acuta per circa 5 giorni, accompagnata da febbre e dolori addominali. È tra i principali agenti causa di tossinfezioni alimentari. Di recente sono stati riportati casi di infezione attribuiti all’ingestione di frutta e vegetali presumibilmente contaminati con rifiuti animali. Una contaminazione crociata può avvenire anche in caso di aggiunta di ingredienti di origine animale alle insalate di quarta gamma. Tuttavia Campylobacter jejuni, sebbene favorito dalle condizioni microaerofile che si vengono a creare nei prodotti confezionati, ha un ottimo di temperatura di 42 °C e non presenta attitudini psicrotrofiche spiccate.

Yersinia enterocolitica
Yersinia spp. è un genere che comprende bacilli o coccobacilli Gram-negativi. Yersinia enterocolitica è parte integrante della microflora intestinale dei suini e tuttavia può moltiplicarsi agevolmente a temperature di refrigerazione anche prossime a 0 °C. Questo microrganismo è in grado di causare diversi sintomi clinici e immunologici: i più comuni sono di natura enterocolitica. Yersinia enterocolitica può contaminare le produzioni primarie attraverso le feci e i prodotti di quarta gamma attraverso la contaminazione crociata all’interno degli stabilimenti di produzione. Yersinia spp., sebbene isolata da frutta e vegetali, incluse lattuga e carote grattugiate, non è mai stata identificata come agente di tossinfezioni determinate da insalate di quarta gamma.

Aeromonas hydrophila
Appartengono al genere Aeromonas microrganismi Gram-negativi di forma coccobacillare comunemente presenti in ambiente acquatico e isolati di frequente dagli alimenti. Non tutti i ceppi sono patogeni; al contrario, la maggior parte di essi è responsabile di alterazioni negli alimenti. Generalmente Aeromonas può contaminare frutta e vegetali freschi attraverso l’acqua. Alcuni ceppi sono psicrotrofi e possono raggiungere livelli di 6 log UFC/g in broccoli, cavolfiore e asparagi in due settimane a 4 °C. Questi microrganismi possono sopravvivere e moltiplicarsi in atmosfera modificata. I ceppi patogeni colpiscono soprattutto i giovani con sintomatologia riconducibile a diarrea e febbre lieve.

Vibrio spp.
Le specie del genere Vibrio (Gram-negativi di forma bastoncellare ricurva) sono frequenti soprattutto nelle acque degli estuari e le patologie determinate da questi microrganismi sono in genere associate al consumo di prodotti ittici. Delle 12 specie patogene, Vibrio cholerae provoca indubbiamente le malattia più grave, il colera. Vibrio parahemolyticus è causa di tossinfezioni da prodotti ittici poco cotti; la sintomatologia, in questo caso, si manifesta dopo anche 96 ore dal consumo e consiste in diarrea, nausea, vomito, crampi addominali e febbre. I prodotti di quarta gamma possono essere contaminati attraverso la contaminazione crociata durante la lavorazione e la miscelazione degli ingredienti, soprattutto nella fase di vendita al dettaglio.

Batteri sporigeni
Batteri patogeni sporigeni quali Clostridium perfringens, Clostridium botulinum e Bacillus cereus possono essere isolati con estrema facilità dal suolo e sono stati sporadicamente rinvenuti in vegetali freschi, vegetali di quarta gamma, semi e germogli. Clostridium botulinum è un microrganismo anarobio produttore di una potente neurotossina che nell’uomo determina una serie di sintomi includenti nausea, vomito, diarrea, nonché sintomi neurologici quali visione doppia, dilatazione delle pupille, paralisi dei nervi motori, perdita delle normali funzioni della bocca e della gola, perdita di coordinazione muscolare e, non infrequentemente, morte. Anche se la produzione di tossina non è stata mai rilevata in prodotti conservati a temperature di refrigerazione, gli abusi termici devono essere assolutamente evitati, soprattutto nei prodotti conservati in atmosfera modificata, al fine di prevenire la germinazione delle spore e lo sviluppo delle cellule vegetative e, di conseguenza, l’accumulo di tossina. Clostridium perfringens e Bacillus cereus producono enterotossine responsabili di crampi addominali e diarrea. Esistono anche ceppi emetici di Bacillus cereus che causano nausea acuta e vomito ma non diarrea. Le cellule di Clostridium perfringens non sono in grado di svilupparsi a temperature inferiori a 10-15 °C. Il rischio per la salute pubblica sorge quando un prodotto contaminato con le spore di questo microrganismo anaerobio viene lavorato e conservato in condizioni che rendono possibile la germinazione delle spore e lo sviluppo delle cellule vegetative, per esempio in caso di fluttuazioni termiche durante il trasporto e la vendita. Se una corretta catena del freddo previene lo sviluppo sia di Clostridium perfringens sia di Clostridium botulinum (con l’eccezione del tipo E, generalmente associato ai prodotti ittici), sono stati isolati ceppi psicrotrofi di Bacillus cereus capaci di moltiplicarsi durante la conservazione a 4 °C. Questi possono quindi rappresentare un potenziale rischio anche per i prodotti di quarta gamma refrigerati.

Virus
I virus sono tra i principali responsabili di patologie trasmesse per via alimentare. Tuttavia, il loro contributo è spesso sottovalutato, anche per la mancanza di protocolli analitici standardizzati atti a rivelarne la presenza negli alimenti. Sono immessi nell’ambiente da individui infetti e, sebbene generalmente non possano moltiplicarsi nei prodotti alimentari, sono in grado di sopravvivere durante la conservazione del prodotto, soprattutto in assenza dell’applicazione di trattamenti termici risananti, come nei vegetali di quarta gamma. Possono anche sopravvivere facilmente nelle acque, attraverso le quali contaminano i prodotti durante irrigazione e lavaggi. Sono noti almeno 150 tipi di virus enterici, che possono essere apportati dalle acque ed essere causa di svariate sintomatologie, che vanno dalle infezioni respiratorie alle gastroenteriti, fino alle meningiti. Ai prodotto freschi, tra i quali rientrano i vegetali di quarta gamma, sono spesso associati il virus dell’epatite A, i norovirus (Norwalk-like) e i rotavirus. Sono stati individuati come vettori di infezioni apportate dal consumo di vegetali (insalata e pomodori) e frutti (lamponi) freschi. Altri tipi di virus riscontrati in questi prodotti sono gli astrovirus, gli enterovirus, i parvovirus e gli adenovirus. I fattori che influenzano la sopravvivenza di questi virus nei prodotti alimentari, e in particolare nei prodotti di quarta gamma, sono perlopiù sconosciuti e costituiscono uno degli obiettivi prioritari di studio del prossimo futuro.

Aspetti normativi

Le normative europee riguardanti la sicurezza e la qualità microbiologica delle insalate di quarta gamma discendono dal Regolamento 2073/2005 della Commissione Europea che disciplina i criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari e dalle modificazioni a esso apportate dal successivo Regolamento 1441/2007. Ovviamente le linee guida di questi due regolamenti hanno come presupposto che gli alimenti non debbano contenere microrganismi né loro tossine o metaboliti in quantità tale da rappresentare un rischio inaccettabile per la salute del consumatore. Per quanto riguarda la presenza di Listeria monocytogenes, i vegetali di quarta gamma, assieme ai germogli, ricadono nella categoria “alimenti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes diversi da quelli destinati ai lattanti e a fini medici speciali”. Questa categoria prevede due possibili criteri. Il primo ammette la presenza massima di 100 ufc/g di questo batterio in un piano di campionamento con n = 5 e c = 0. Questo criterio si applica ai prodotti immessi sul mercato durante il loro periodo di conservabilità. Come specificamente definito nel Regolamento, “questo criterio si applica se il produttore è in grado di dimostrare con soddisfazione dell’autorità competente che il prodotto non supererà il limite di 100 ufc/g durante il periodo di conservabilità. L’operatore può fissare durante il processo limiti intermedi sufficientemente bassi da garantire che il limite di 100 cfu/g non sia superato al termine del periodo di conservabilità”. In alternativa, si applica il criterio dell’assenza qualitativa di Listeria monocytogenes in cinque campioni distinti di 25 g ciascuno, determinata prima che gli alimenti non siano più sotto il controllo diretto dell’operatore del settore alimentare che li produce. Per quanto concerne invece Salmonella, la normativa europea per i germogli e le insalate di quarta gamma prevede l’assenza di questo patogeno (5 campioni di 25 g ciascuno) durante tutta la fase di conservabilità del prodotto. Le stesse direttive indicano anche i criteri di igiene che devono essere mantenuti durante il processo. Per i vegetali di quarta gamma questo criterio contempla il numero di Escherichia coli presente nel prodotto al termine della lavorazione. In verità, sia i coliformi totali sia quelli fecali (ed Escherichia coli è una specie riconducibile a queste popolazioni microbiche) sono stati per molto tempo considerati indice di contaminazione fecale (quindi di cattiva gestione igienica del processo) e spesso il loro numero viene anche considerato un indicatore indiretto della presenza di organismi patogeni con habitat analoghi (Salmonella, Vibrio, virus). Questo assunto è stato negli ultimi anni sempre più soggetto a revisioni critiche in base ai dati sperimentalmente acquisiti. Il Regolamento 2073/2005 riporta un parere del Comitato Scientifico per le Misure Veterinarie in relazione alla Salute Pubblica (CSMVSP) secondo il quale, riferendosi peraltro ai frutti di mare, “gli indicatori fecali convenzionali non sono affidabili per dimostrare la presenza di virus Norwalk simili (norovirus)”. Lo stesso Comitato indirizza piuttosto al conteggio di Escherichia coli come indicatore indiretto. Il CSMVSP si esprime altresì circa la presenza di Escherichia coli verocitossici (VTEC) sottolineando come sia “poco probabile che l’applicazione a VTEC O157 di una norma microbiologica per prodotti finali produca una riduzione significativa dei rischi connessi per i consumatori”. D’altro canto, il CSMVSP, nel caso specifico, individua la procedura migliore per prevenire questo rischio nella riduzione della contaminazione fecale e rimanda quindi ai criteri utilizzati per valutarla. Tra i prodotti a rischio per VTEC il CSMVSP individua specificamente “i prodotti freschi, in particolare i semi germogliati e i succhi di frutta e di ortaggi non pastorizzati”. Per quanto concerne dunque i criteri di igiene, per frutta e ortaggi pretagliati pronti al consumo la normativa comunitaria prevede limiti specifici per Escherichia coli durante tutto il processo di lavorazione. Le procedure di campionamento prevedono la preparazione di 5 campioni (n = 5, c = 2) con valori di riferimento per Escherichia coli pari a m = 100 ufc/g e M = 1000 ufc/g. Il risultato deve considerarsi soddisfacente se tutti i campioni presentano valori inferiori a m, accettabile se al massimo due campioni presentano risultati compresi tra m ed M e insoddisfacente se più di due campioni presentano risultati compresi in questo intervallo o nel caso che anche un solo campione presenti conteggi di Escherichia coli superiori a M.

 


Coltura & Cultura