Volume: l'ulivo e l'olio

Sezione: ricerca

Capitolo: Analisi NMR

Autori: Marco Chiarini, Luisa Mannina

Introduzione

Una delle cose più affascinanti della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è la sua complessità, che può essere allo stesso tempo fonte di stimolo intellettuale alla comprensione e motivo di frustrazione per coloro che vogliano comprendere e utilizzare a fondo questa tecnica analitica. Fortunatamente, come molte altre tecniche fisiche di analisi utilizzate per lo studio di sistemi biologici, l’NMR può essere utilizzato in modo empirico, per esempio semplicemente seguendo le variazioni spettrali dovute alle alterazioni di alcuni parametri sperimentali. Anche se per alcune applicazioni NMR l’approccio allo strumento può essere fruttuoso anche ignorando completamente i principi che lo sottendono, per una migliore comprensione dei risultati ottenuti, e per sapere quali informazioni si possono ricavare dalla tecnica NMR, è essenziale conoscerne i principi. Il fenomeno della risonanza magnetica nucleare può essere descritto molto semplicemente come l’assorbimento di energia da parte di un campione immerso in un campo magnetico e irraggiato con onde elettromagnetiche alla frequenza appropriata (generalmente onde radio). La frequenza della radiazione da utilizzare dipende da tre parametri: il tipo di nucleo (1H, 13C, 31P, 14N, 15N ecc.), l’intensità del campo magnetico in cui i nuclei sono immersi e l’intorno chimico del nucleo stesso. L’omogeneità dell’intensità del campo magnetico è fondamentale per la risonanza NMR ad alta risoluzione (esso non deve variare più di 10 ppb nell’intero volume del campione), mentre una sua variazione controllata (utilizzando bobine di filo conduttore che possano generare campi magnetici meno intensi di quello principale) è alla base di altre tecniche di risonanza nucleare come MRI (risonanza nucleare di imaging) o misure di diffusione. Inoltre la misura del tempo necessario ai nuclei per dissipare l’energia assorbita può essere utilizzata per ricavare informazioni sui processi dinamici che avvengono nel campione.

Risonanza magnetica nucleare nell’olio di oliva

Di seguito è proposto un confronto tra le analisi convenzionali e l’informazione che si può ottenere con la tecnica NMR.

Acidità libera

Una delle analisi convenzionali più conosciute è la misura dell’acidità libera ottenuta con metodi chimici tradizionali. Lo spettro 1H di un olio di oliva non permette di ottenere questa informazione direttamente, ma è possibile ricavare una misura indiretta dell’acidità misurando la quantità di digliceridi presenti. Lo spettro 1H di un olio di oliva mostra le risonanze delle catene in posizione sn 1,2 e sn 1,3 del glicerolo a 3,639 e 3,994 ppm rispettivamente. La quantità totale di digliceridi e il rapporto 1,2/1,3 sono strettamente correlati alla qualità e alla freschezza del prodotto; infatti oli vecchi o conservati male (definiti anche lampanti se l’acidità libera è molto elevata o sono presenti difetti organolettici) hanno una quantità di digliceridi molto elevata rispetto agli oli extravergini ben conservati e con un rapporto 1,2/1,3 basso. Va sottolineato, infatti, che con il tempo gli 1,2-digliceridi sempre presenti nell’olio extravergine si trasformano per trasposizione in 1,3-digliceridi.

Analisi degli acidi grassi
Una delle analisi convenzionali più importanti è la determinazione del profilo degli acidi grassi effettuato mediante gas cromatografia. La gas cromatografia permette di ottenere la quantità di ogni acido grasso presente nell’olio; un tipico gas cromatogramma dà la composizione in acidi grassi in termini di C14:0, C16:0, C16:1, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, C20:0, C20:1, C22:0, C24:0. Questo tipo di analisi così dettagliata non può essere effettuata tramite la spettroscopia 1H NMR. Infatti, a causa della sovrapposizione dei segnali, nello spettro 1H NMR è possibile distinguere solo le classi di acidi grassi, ovvero gli acidi grassi con 0, 1, 2 o 3 doppi legami. Informazioni importanti sulla distribuzione degli acidi grassi sullo scheletro del glicerolo possono essere ottenute attraverso la spettroscopia 13C NMR. Il metodo riconosciuto dal regolamento comunitario per la determinazione della distribuzione delle catene è un metodo enzimatico molto laborioso e non molto accurato. È importante sottolineare che la gas cromatografia fornisce la completa composizione in acidi grassi ma non dà alcuna informazione sulla distribuzione delle catene grasse sul glicerolo. Quindi le due tecniche, GC e NMR, devono essere considerate complementari e non alternative.

Analisi degli steroli
Le analisi convenzionali degli steroli previste dalla normativa europea sono effettuate tramite la gas cromatografia. Lo spettro protonico permette di avere informazioni sugli steroli grazie alla presenza della risonanza del CH3 in posizione 18 della struttura molecolare degli steroli, sempre in una regione spettrale molto stretta (0,6-0,7 ppm) ed esente da sovrapposizioni di altre risonanze. In un qualunque olio vegetale è possibile osservare questa utile piccola regione spettrale e quindi ottenere informazioni sulla composizione sterolica. Mentre in oli extravergini di oliva è presente solo il β-sitosterolo, uno sterolo “buono”, in oli di semi è evidente la presenza anche di altri steroli sicuramente meno buoni. Si può anche confrontare la risonanza del β-sitosterolo con la risonanza satellite del 13C del metile degli acidi grassi.

Determinazione di squalene, cicloartenolo e clorofilla priva di Mg
Lo squalene è sempre presente negli oli di oliva in quantità variabile tra 12,5 e 75 mg/1000 g di olio. Nello spettro dell’olio di oliva è possibile riconoscere sempre un singoletto a 1,620 ppm, dovuto a un gruppo metilico. Quando questa risonanza non è osservabile, siamo in presenza di oli rettificati o comunque adulterati. Lo spettro protonico mostra anche la presenza di cicloartenolo. Il cicloartenolo è uno steroide complesso caratterizzato dalla presenza di un anello a tre atomi di carbonio. Una frode che può essere rilevata con la tecnica protonica NMR è l’aggiunta, nell’olio, di clorofilla. Questa frode è atta a intensificare il colore verde dell’olio e a rendere, quindi, il prodotto più invitante per i consumatori. La clorofilla ha una struttura porfirinica in cui è normalmente presente il magnesio legato con legami di coordinazione. Solitamente, però, la clorofilla aggiunta è degradata e al posto del magnesio è presente, nel macrociclo, il gruppo NH. In questo caso lo spettro protonico dell’olio presenta a campi alti, a circa –0,4 ppm, un segnale molto largo dovuto proprio al segnale NH.

Acidi grassi insaturi

Il metodo convenzionale per determinare il grado totale di insaturazione è una misura del numero di iodio (N.I.). Il numero di iodio degli acidi grassi insaturi non è una misura quantitativa, ma è solo un numero empirico utile per avere un’informazione qualitativa sulla quantità totale di insaturazione. Lo spettro protonico dell’olio di oliva permette, invece, la misura quantitativa degli acidi grassi insaturi. In aggiunta, attraverso lo spettro 13C dell’olio di oliva, è possibile avere l’intera composizione delle catene insature analizzando la regione spettale tra 120 e 130 ppm.

Caratterizzazione geografica degli oli di oliva
La definizione dell’origine geografica di un olio di oliva è argomento di grande attualità e molto dibattuto. Con un importante atto legislativo comunitario è stato definito il concetto di DOP (Denominazione di Origine Protetta) che permette di identificare alcuni oli extravergini con il nome dell’area in cui vengono prodotti. Questa certificazione intende aumentare il valore anche commerciale dei prodotti italiani, greci e spagnoli. La composizione di un olio di oliva è il risultato di diversi elementi come l’area di provenienza, la cultivar ecc. Da un punto di vista analitico, in letteratura si trovano esempi di metodiche atte a identificare l’origine geografica della produzione delle olive attraverso analisi multivariate di parametri chimici idonei. Per esempio utilizzando l’analisi della componente principale (PCA) è stato possibile distinguere tra loro oli di oliva provenienti da differenti regioni italiane o classificare oli greci a secondo della loro provenienza geografica. La combinazione della spettroscopia NMR ad alta risoluzione con un’appropriata analisi statistica ha permesso di ottenere risultati interessanti nella classificazione degli oli di oliva.

Risonanza di spin elettronico (EPR)

Una delle proprietà della materia è il magnetismo. Da un punto di vista macroscopico tutte le sostanze sono magnetiche, indicando con questo termine la loro capacità di interagire con un campo magnetico. Ma da dove deriva questo magnetismo? Possiamo individuare a livello microscopico tre sorgenti differenti: – la circolazione di una corrente elettrica; – il momento magnetico dell’elettrone; – il momento magnetico del nucleo. I primi due contributi elettronici sono quasi sempre di entità largamente superiore al contributo del nucleo; si può quindi misurare l’interazione delle onde elettromagnetiche con lo spin elettronico oltre che con lo spin nucleare. La tecnica che sfrutta questa interazione è detta EPR (Electron Paramagnetic Resonance) oppure ESR (Electron Spin Resonance).

Applicazioni EPR nell’olio di oliva
Studi recenti hanno suggerito che la bassa incidenza di malattie cardiovascolari nella popolazione dell’area mediterranea sia dovuta, tra gli altri fattori, alle proprietà antiossidanti di vitamine, come la vitamina E, e composti polifenolici presenti nell’olio di oliva largamente utilizzato nell’alimentazione di queste popolazioni. È stato tra l’altro dimostrato che i polifenoli presenti nell’olio di oliva, specialmente in quello extravergine, sono dei potenti antiradicali sia in vitro sia in vivo; inoltre contribuiscono alla stabilizzazione degli acidi grassi liberi. I polifenoli negli oli vegetali variano sia in qualità sia in quantità a seconda dell’origine e dei processi di trasformazione adottati. Il potere antiossidante (antiradicalico) di un olio o di sue frazioni estratte con solventi a polarità differente può essere valutato misurando la variazione dell’intensità dello spettro EPR di un radicale stabile quale il 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH), il sale di Fremy (nitrosodisolfonato di potassio), il radicale galvinossile [radicale 1,6-di-terz-butil-α-(3,5-di-terz-butil-4-osso2,5-cicloesadien-1-ilidene)-p-tolilossile], indotto dall’estratto o dall’olio e comparandolo con l’effetto di molecole antiossidanti come i tocoferoli, l’acido gallico, la quercetina. Il metodo si basa sulla reazione che avviene tra il radicale stabile, per esempio il DPPH, e l’antiossidante (AH)n. Questa reazione consuma il radicale e fa diminuire il suo segnale EPR, poiché l’area del segnale è proporzionale al contenuto di radicali liberi, ed è possibile confrontare questo dato, che è una misura del potere antiossidante del campione, con la misura ottenuta con una sostanza antiossidante standard. La reazione che avviene può essere così schematizzata:
DPPH• + (AH)n → DPPH − H + (A•)n
Un altro esempio di applicazione della spettroscopia EPR nello studio dell’olio di oliva è la misura della sua stabilità ossidativa. Utilizzando molecole chiamate spin-trap, cioè dei composti tipo l’N-benzilidene-terz-butilamina N-ossido (PBN), è possibile misurare la cinetica di produzione di radicali liberi all’interno di una matrice alimentare a seguito di processi di trasformazione seguendo, per via EPR, la velocità di comparsa del segnale dovuto al radicale stabile che si forma per reazione dei radicali labili, formati durante il processo, con lo spin-trap. Inoltre, in alcuni casi è stato possibile identificare la natura dei radicali labili che si formano durante i processi di trasformazione. In definitiva la spettroscopia EPR accoppiata con la metodica di spin-trapping è sensibile e di semplice applicazione per misurare la stabilità ossidativa e il potere antiossidante degli oli di oliva.


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